豬瘟病毒中等致病力毒株在體內(nèi)的動態(tài)分布

孫駿翔，張乾義，徐和敏，王團(tuán)結(jié)，徐璐，鄒興啟，朱元源，李翠，夏應(yīng)菊，徐嫄，陳鍇，張玉杰，趙啟祖，王琴

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豬瘟病毒中等致病力毒株在體內(nèi)的動態(tài)分布

孫駿翔1，張乾義1，徐和敏2，王團(tuán)結(jié)1，徐璐1，鄒興啟1，朱元源1，李翠1，夏應(yīng)菊1，徐嫄1，陳鍇1，張玉杰1，趙啟祖1，王琴1

（1中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，國家/OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 100070）

【目的】目前我國豬瘟的感染類型主要是亞急性感染及慢性感染，研究豬瘟亞急性感染后體內(nèi)病毒RNA和蛋白的分布情況，有助于闡述亞急性病程豬瘟病毒的復(fù)制分布規(guī)律，為豬瘟的早期診斷和預(yù)防奠定重要基礎(chǔ)?！痉椒ā砍晒σ灾械戎虏×Χ局辏℉eBHH1/95）構(gòu)建了亞急性豬瘟感染動物模型，分別采集感染后第1、3、6、10、13、20、24、28 天感染豬的十二指腸、脾臟、腎臟、肺臟、胰、回盲瓣6種組織器官并進(jìn)行連續(xù)切片。應(yīng)用建立的豬瘟病毒可視化原位雜交技術(shù)（ViewRNA ISH ）研究感染組織中病毒RNA動態(tài)分布，同時采用免疫組化（IHC）、H.E染色分別檢測感染組織中蛋白的分布情況及其組織損傷位置，從而在病毒核酸和蛋白水平系統(tǒng)性的觀察病毒的分布情況?！窘Y(jié)果】采用Mittelholzer方法進(jìn)行臨床計(jì)分發(fā)現(xiàn)感染后6—10 d感染豬豬瘟臨床癥狀記分迅速增加，11—26 d感染豬臨床記分一直維持在15分左右，直到28 d臨床記分達(dá)到最高值20分。感染后8—10 d感染豬體溫呈上升趨勢；13—24 d感染豬體溫呈現(xiàn)稽留熱，持續(xù)在40℃左右；此后體溫開始回落，至瀕死前體溫回落至39.5℃左右。應(yīng)用CSFV ViewRNA ISH感染后第1 天在十二指腸絨毛杯狀細(xì)胞及胰腺的腺泡、回盲瓣的固有層、腎臟的腎小管等這些具有分泌功能的結(jié)構(gòu)組織周圍檢測到病毒RNA陽性信號；感染后第3天在肺臟的細(xì)支氣管和脾臟的橢圓體周圍檢測到病毒RNA陽性信號；第13天陽性信號富集顯著，至第28天病毒RNA廣泛分布在脾臟動脈周圍淋巴鞘及胰腺腺泡和腎小管等組織周圍。采用IHC和H.E染色法在連續(xù)切片的相似視野下驗(yàn)證ViewRNA ISH檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)感染后第1天十二指腸、胰腺、腎臟亦可檢測到病毒蛋白陽性信號和相應(yīng)組織的病理變化，但回盲瓣在第3天檢測到病毒蛋白陽性信號和組織的病理變化，在之后的病程中各組織中病毒RNA、蛋白定位情況趨于一致，第28天病毒蛋白集中在脾臟動脈周圍淋巴鞘及胰腺腺泡等周圍?！窘Y(jié)論】采用ViewRNA ISH方法在回盲瓣中可以早于IHC發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒，各個組織中ViewRNA ISH檢測到病毒部位與IHC檢測到病毒部位及H.E檢測到的組織損傷部位相似，表明ViewRNA ISH具有良好的靈敏性可以應(yīng)用于檢測感染早期病毒在組織中的分布。前期病毒RNA通常在胰腺腺泡、腎小管及脾臟的橢圓體周圍復(fù)制，在感染中期病毒在各組織結(jié)構(gòu)中大量增殖，感染后期病毒不僅在淋巴細(xì)胞周圍富集，還易在具有分泌功能的部位復(fù)制增殖。

豬瘟病毒；中等致病力； RNA；可視化原位雜交；分布

0 引言

【研究意義】豬瘟（classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的豬的高度接觸性、致死性傳染病[1]，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害[2]。目前我國豬瘟的感染類型主要是亞急性感染及慢性感染，但因發(fā)病緩慢或不易察覺，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來極大損失[3]，造成這種感染類型的主要病原是中等致病力豬瘟毒株[4]。研究亞急性豬瘟感染后病毒RNA在體內(nèi)的動態(tài)分布有助于闡述亞急性病程中CSFV的復(fù)制分布規(guī)律，為當(dāng)前CSF的早期診斷和預(yù)防提供技術(shù)保障。【前人研究進(jìn)展】國內(nèi)外研究多集中在動物體感染過程中病毒蛋白分布，且已經(jīng)證實(shí)病毒蛋白載量與組織嗜性及病程密切相關(guān)[5]。豬瘟慢性感染病程中扁桃體、頜下淋巴結(jié)、肝臟、心肌等組織的病毒RNA動態(tài)載量研究已經(jīng)證實(shí)了扁桃體等淋巴器官是CSFV侵入宿主的主要器官[6]。但是CSFV侵入宿主后對其他組織的嗜性及病毒核酸在組織中具體結(jié)構(gòu)的定位依然不清楚，因此需要進(jìn)行深入的研究。ViewRNA ISH是一種基于原位雜交發(fā)展起來的可以定位RNA的技術(shù)。目前，該技術(shù)已經(jīng)在生物學(xué)方面有了廣泛應(yīng)用，在神經(jīng)生物學(xué)方面，ViewRNA ISH與微流體芯片技術(shù)共同驗(yàn)證了Eef1a1、Ctnnb1、Nrxn3等轉(zhuǎn)錄本存在于軸索中[7]，表明成熟的皮質(zhì)軸突包含一些特殊的細(xì)胞骨架、蛋白運(yùn)輸及線粒體維護(hù)等轉(zhuǎn)錄本。在尋找腫瘤治療靶點(diǎn)的研究中，應(yīng)用此技術(shù)對外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulatingtumor cells，CTCs）進(jìn)行RNA的原位雜交，鑒定出Wnt 2在CTCs中高表達(dá)，可作為治療靶點(diǎn)，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[8]。ZHANG等[9]應(yīng)用ViewRNA ISH觀察到CSFV感染PK15后，病毒RNA在體外吸附和進(jìn)入靶細(xì)胞時間早于0.5 小時。這些研究說明了ViewRNA ISH對細(xì)胞中特定RNA進(jìn)行定位和檢測具有很好的可行性。【本研究切入點(diǎn)】但是，在豬瘟亞急性感染病程中，病毒RNA在感染豬組織器官中的分布研究還未見報(bào)道，本研究應(yīng)用ViewRNA ISH在核酸水平觀察CSFV在組織中的分布情況，同時應(yīng)用IHC、H.E染色驗(yàn)證ISH的觀測結(jié)果?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在構(gòu)建病程持續(xù)28 d的亞急性豬瘟感染動物模型的基礎(chǔ)上，采用ViewRNA ISH對中等致病力CSFV感染后免疫器官、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等各組織中病毒RNA的分布動態(tài)進(jìn)行系統(tǒng)研究，對闡明中等致病力CSFV的致病機(jī)理具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年7月至2017年5月在中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，國家/OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用豬：購自河北保定某豬場，選取10 kg左右，30日齡，健康斷奶大白仔豬。

抗體檢測試劑盒：CSFV抗體檢測試劑盒由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家/OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室提供；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）抗體檢測試劑盒、豬偽狂犬病病毒（PRV）抗體檢測試劑盒、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）抗體檢測試劑盒均購自IDEXX公司；豬細(xì)小病毒（PPV）抗體檢測試劑盒購自PrioNics公司；豬圓環(huán)病毒（PCV）抗體檢測試劑盒購自科前生物制品有限責(zé)任公司；口蹄疫病病毒（FMDV）抗體檢測試劑盒深圳綠詩源生物技術(shù)有限公司。

病原檢測試劑：CSFV、PRRSV、PRV、PPV、PCV（I型和II型）、BVDV、FMDV病原檢測引物由Invitrogen公司合成；FQ-PCR主要試劑：SuperScriptTMIII 反轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen公司；Taq HS DNA聚合酶，10×PCR Buffer等購自寶生物工程（大連）有限公司；核酸提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

CSFV ViewRNA ISH試劑：CSFV 特異性探針、ACTB探針的合成以及試劑盒的組裝由美國Affymetrix公司完成。

IHC試劑：CSFV E2蛋白單克隆抗體WH303由英國APHA實(shí)驗(yàn)室贈送；羊抗鼠IgG購自康為世紀(jì)；顯色液購自美國Vector Laboratories。

其他試劑：無水乙醇、二甲苯、甲醛、氨水、過氧化氫、檸檬酸鈉等購自北京化學(xué)試劑有限公司。

Thermobrite ViewRNA ISH儀，美國雅培公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的CSFV SM 株（AF333000）設(shè)計(jì)ISH探針序列，對豬看家基因β-actin（ACTB）（AK237086）的mRNA序列設(shè)計(jì)特異性探針作為內(nèi)參。

CSFV探針序列：

P1：GGA CTA GCA AAC GGA GGG ACTA GCC GTA GTG GCG AGC TCC CTG GGT GGT CTA AGT CCT GAG TAC AGG ACA GTC GTC AAT AGT TCG ACG TGA GCA GGA GC；

P2：TAT GAT TTA TTG CAA GCC CAG AGGTAC GGT ATA G AA GAC GGG ATA AAT ATC ACC AAA TCC T；

P3：AGG TGG TCA GAC AAC ACT TCT AGT TAC ATG CCG GGG AGA AAT ACA ACC ACA ATCCTA GCT AAA ATG GCC ACA AGG TTA GAT TCC AGT GGT GAG AGG GGT ACC ATA GCA TAT GAG AAA GCA GTA GCA TTC AGC TTC CTG CTG ATG TAC T。

ACTB探針序列：

ACTB：TTC CTT CCT GGG TAT GGA ATC CTG TGG CAT CCA CGA AAC TAC CTT CAA CTC AAT CAT GAA。

1.2.2 試驗(yàn)用豬的篩選 試驗(yàn)前采集斷奶仔豬的全血，對其進(jìn)行CSFV、PRRSV、PRV、PPV、PCV（I型和II型）、BVDV、FMDV 8種重要豬病病原和抗體的篩查。選取病原、抗體全部陰性豬作為本次實(shí)驗(yàn)動物。

1.2.3 豬瘟亞急性感染模型的構(gòu)建和樣本采集 試驗(yàn)用豬共18頭隨機(jī)分成2組：試驗(yàn)組16頭，每頭豬頸部肌肉注射1.5×103.66TCID50的CSFV中等致病力毒株（HeBHH1/95）；對照組2頭，頸部肌肉注射等量無菌生理鹽水，將兩組實(shí)驗(yàn)動物隔離飼養(yǎng)。從感染前一天進(jìn)行體溫測定，參照文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行臨床打分。在感染后第1、3、6、10、13、20、24、28 天（day post infection, dpi）剖殺試驗(yàn)豬，采集十二指腸、胰腺、脾臟、回盲瓣、腎臟、肺臟等6種組織器官保存于多聚甲醛中，制成石蠟切片，備用。

1.2.4 感染組織中 CSFV ViewRNA ISH方法優(yōu)化 切片經(jīng)過脫蠟水化、1%蛋白酶K處理組織、預(yù)雜交液處理組織、探針雜交、細(xì)胞核藍(lán)染后使用光學(xué)顯微鏡觀察。根據(jù)Affymetrix ViewRNA ISH說明書提供的蛋白酶孵育時間范圍（5—20 min）及組織預(yù)處理液煮沸時間范圍（5—20 min），采用正交試驗(yàn)對1.2.3制備的切片優(yōu)化反應(yīng)條件、時間。采用優(yōu)化后的條件對切片進(jìn)行ViewRNA ISH方法檢測。

1.2.5 豬瘟亞急性感染組織間接IHC檢測法 參考朱長康[11]CSFV間接IHC檢測法對1.2.3制備的切片進(jìn)行病毒定位檢測，采用Vector顯色液顯色觀察。

1.2.6 豬瘟亞急性感染組織H.E染色 參考文獻(xiàn)[12]的H.E染色法對1.2.3制備的切片進(jìn)行H.E染色。

2 結(jié)果

2.1 豬瘟亞急性感染模型的構(gòu)建

根據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法（0—30分），對CSFV中等致病力毒株（HeBHH1/95）感染豬體后進(jìn)行臨床記分：1—5 dpi感染豬臨床癥狀得分較低，少于5分；6—10 dpi感染豬臨床癥狀記分迅速增加；11—26 dpi感染豬臨床得分一直維持在15分左右，直到28 dpi臨床記分達(dá)到最高值20分，結(jié)果見圖1。感染后每天兩次對豬進(jìn)行體溫測定，取其算術(shù)平均值：潛伏期內(nèi)感染豬體溫正常；8—10 dpi感染豬體溫呈上升趨勢；13—24 dpi患畜體溫總體呈現(xiàn)熱稽留，持續(xù)在40℃左右；此后體溫開始回落，至瀕死前體溫回落至39.5℃左右，對照組體溫一直維持在（39±0.5）℃，結(jié)果見圖2。根據(jù)感染豬臨床記分、體溫測定指標(biāo)及病程，成功構(gòu)建了CSFV亞急性感染動物模型。

圖1 CSFV中等致病力毒株（HeBHH1/95）感染豬體臨床打分圖

圖2 CSFV中等致病力毒株（HeBHH1/95）感染豬體溫變化情況

2.2 CSFV ViewRNA ISH方法優(yōu)化

參考組織形態(tài)及CSFV RNA信號強(qiáng)度，各組織器官的預(yù)處理液的煮沸時間及蛋白酶的消化時間優(yōu)化結(jié)果如表1

表1 各組織器官的預(yù)處理液煮沸時間及蛋白酶消化時間

2.3 豬瘟亞急性感染組織器官CSFV ViewRNA ISH、IHC與H.E染色的檢測

ViewRNA ISH結(jié)果顯示，1 dpi十二指腸的杯狀細(xì)胞周圍檢測到病毒 RNA，整個病程中，腸絨毛病毒 RNA逐漸增多；IHC結(jié)果顯示，1 dpi檢出病毒蛋白，整個病程中，病毒蛋白含量及分布與CSFV ViewRNA ISH相似。10—13 dpi 病毒 RNA信號及蛋白信號強(qiáng)度顯著增加；H.E結(jié)果顯示，1 dpi腸絨毛出現(xiàn)出血和淋巴浸潤，隨著病程延長，腸絨毛柱狀上皮細(xì)胞脫落（圖3）。

ViewRNA ISH結(jié)果顯示，1 dpi胰腺的腺泡出檢測到RNA信號，隨著病程延長，CSFV在腺泡及朗格罕島的含量逐漸增加；IHC結(jié)果顯示，1 dpi可以檢測到病毒蛋白陽性信號存在于腺泡，在整個病程中病毒蛋白均集中于腺泡及朗格罕島；H.E結(jié)果顯示，3 dpi腺泡周圍出血，10 dpi后腺泡結(jié)構(gòu)不清（圖4）。

ViewRNA ISH結(jié)果顯示，1 dpi回盲瓣的李氏隱窩及固有層檢測到病毒RNA信號，隨著病程延長，CSFV含量在該位置逐漸增加；IHC結(jié)果顯示，1 dpi未見病毒蛋白陽性信號，3 dpi可以檢測到病毒蛋白陽性信號存在于固有層和李氏隱窩，隨著病程延長，病毒蛋白含量逐漸增加；H.E結(jié)果顯示，3 dpi固有層有炎性細(xì)胞浸潤同時伴隨充血，10—28 dpi，杯狀細(xì)胞萎縮凋亡（圖5）。

ViewRNA ISH結(jié)果顯示，3 dpi脾臟橢圓體周圍有少量病毒RNA，6 dpi動脈周圍淋巴鞘出現(xiàn)病毒RNA陽性信號，20—28 dpi邊緣區(qū)的病毒RNA含量大量增加；IHC結(jié)果顯示，3 dpi在橢圓體周圍有病毒蛋白陽性信號，6 dpi動脈周圍淋巴鞘及邊緣區(qū)出現(xiàn)病毒蛋白信號；H.E結(jié)果顯示，3 dpi脾臟動脈周圍淋巴鞘邊緣區(qū)域開始出現(xiàn)部分紅細(xì)胞，并且有少量炎性細(xì)胞浸潤，20 dpi后脾臟呈現(xiàn)彌漫性出血，并且脾臟組織結(jié)構(gòu)難以辨認(rèn)（圖6）。

a表示ViewRNA ISH檢測結(jié)果，其中CSFV的RNA靶序列被染成紅色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色。b表示IHC檢測結(jié)果，其中CSFV的靶蛋白被染成玫紅色。c表示H.E染色結(jié)果.用注射生理鹽水豬做陰性對照。IV：腸絨毛；GC：杯狀細(xì)胞

a表示ViewRNA ISH檢測結(jié)果，其中CSFV的RNA靶序列被染成紅色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色。b表示IHC檢測結(jié)果，其中CSFV的靶蛋白被染成玫紅色。c表示H.E染色結(jié)果。用注射生理鹽水豬做陰性對照。PA：腺泡；PI：朗格罕島

a表示ViewRNA ISH檢測結(jié)果，其中CSFV的RNA靶序列被染成紅色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色。b表示IHC檢測結(jié)果，其中CSFV的靶蛋白被染成玫紅色。c表示H.E染色結(jié)果.用注射生理鹽水豬做陰性對照。LP：固有層；LC：李氏隱窩

ViewRNA ISH結(jié)果顯示，1 dpi腎臟的腎小球、腎小管檢測到病毒陽性信號，10 dpi 病毒信號主要集中在腎小管和腎小球；IHC結(jié)果顯示，1 dpi在腎小管中檢測到病毒蛋白陽性信號，3 dpi發(fā)現(xiàn)腎小球存在病毒蛋白，隨著病程延長，病毒蛋白集中在腎小管；H.E結(jié)果顯示，1—6 dpi腎小球毛細(xì)血管充血，腎小管間隙可見少量出血，在10—13 dpi出血更為嚴(yán)重，并出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞，20—28 dpi腎小球囊腔縮小，部分幾乎不可見，呈現(xiàn)纖維化（圖7）。

a表示ViewRNA ISH檢測結(jié)果，其中CSFV的RNA靶序列被染成紅色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色。b表示IHC檢測結(jié)果，其中CSFV的靶蛋白被染成玫紅色。c表示H.E染色結(jié)果.用注射生理鹽水豬做陰性對照。E：橢圓體；PALS：動脈周圍淋巴鞘；MZ：邊緣區(qū)

a表示ViewRNA ISH檢測結(jié)果，其中CSFV的RNA靶序列被染成紅色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色。b表示IHC檢測結(jié)果，其中CSFV的靶蛋白被染成玫紅色。c表示H.E染色結(jié)果.用注射生理鹽水豬做陰性對照。G：腎小球；RT：腎小管

ViewRNA ISH結(jié)果顯示，3 dpi肺臟的細(xì)支氣管附近檢測到病毒RNA，整個病程中，病毒 RNA含量略有增加；IHC結(jié)果顯示，3 dpi檢出病毒蛋白，整個病程中，病毒蛋白含量均較低；H.E結(jié)果顯示，在3 dpi肺間質(zhì)增厚充血并出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞，支氣管內(nèi)可見出血，在6—13 dpi血管內(nèi)可見大量血細(xì)胞、少量脫落的組織細(xì)胞和其他分泌物，并伴有炎性細(xì)胞浸潤，20—28 dpi，肺間質(zhì)充血明顯緩解（圖8）。

a表示ViewRNA ISH檢測結(jié)果，其中CSFV的RNA靶序列被染成紅色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色。b表示IHC檢測結(jié)果，其中CSFV的靶蛋白被染成玫紅色。c表示H.E染色結(jié)果.用注射生理鹽水豬做陰性對照。B：細(xì)支氣管；LI：肺間質(zhì)

3 討論

ViewRNA ISH是一種新型原位雜交技術(shù)，融合了傳統(tǒng)原位雜交技術(shù)與熒光原位雜交（FISH）技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)[13]。通過設(shè)計(jì)目的基因的“Z”型結(jié)構(gòu)特異探針，利用“Z”型探針底部與經(jīng)蛋白酶消化后暴露的靶RNA雜交，之后加入標(biāo)記引物與相應(yīng)的“L”型標(biāo)記探針，使得一個轉(zhuǎn)錄樣本便可產(chǎn)生8 000倍的放大效應(yīng)。ViewRNA ISH基于特殊的探針設(shè)計(jì)與專有的信號放大方法[14]，在準(zhǔn)確性、靈敏度、重復(fù)性等方面較常規(guī)原位雜交技術(shù)都有大幅提高[15]，可以在單細(xì)胞中對多個目標(biāo)基因的低拷貝乃至單拷貝RNA做出檢測。ViewRNA ISH具有操作周期短，一天內(nèi)可以完成的優(yōu)點(diǎn)。相對于不易獲取抗體的免疫組化和免疫熒光試驗(yàn)，ViewRNA ISH針對目標(biāo)基因或序列，可以進(jìn)行靈活的探針設(shè)計(jì)，新探針設(shè)計(jì)一周內(nèi)可完成，實(shí)現(xiàn)了縮短試驗(yàn)周期的目標(biāo)。因此，通過設(shè)計(jì)CSFV RNA與β-actin RNA探針并優(yōu)化了CSFV ViewRNA ISH方法，為研究豬瘟亞急性感染后體內(nèi)病毒RNA和蛋白的分布情況，有助于闡述亞急性病程病毒的復(fù)制分布規(guī)律，為豬瘟的早期診斷和預(yù)防奠定重要基礎(chǔ)。

根據(jù)豬瘟病程長短、臨床癥狀等可將豬瘟分為急性型、亞急性型、慢性型等不同類型。其中亞急性型豬瘟一般病程達(dá)21—30 d[2]，患畜精神沉郁，食欲下降或停食，體溫一般升高至40.5℃左右，便秘、腹瀉交替出現(xiàn)。亞急性型豬瘟動物模型的構(gòu)建主要與病毒致病力和接種劑量有關(guān)，本研究應(yīng)用1.5×103.66TCID50的中等致病力毒株HeBHH1/95成功構(gòu)建出與上述癥狀相似的亞急性動物模型。

本試驗(yàn)為保證檢測結(jié)果的可靠性，對豬瘟亞急性感染豬的組織器官連續(xù)切片后在相似視野下進(jìn)行CSFV ViewRNA ISH、IHC和H.E進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)CSFV ViewRNA ISH在1 dpi即可檢測出回盲瓣的固有層存在病毒RNA，而IHC和H.E在3 dpi才可在回盲瓣中檢測到病毒蛋白和組織的病變，這表明ViewRNA ISH有很好的靈敏性且試驗(yàn)周期要短于IHC和H.E，是一種快速、靈敏的原位檢測病毒RNA的方法。應(yīng)用CSFV ViewRNA ISH發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞核內(nèi)同樣存在病毒RNA，這與張玉杰等[16]CSFV在PK15細(xì)胞中定位結(jié)果一致，提示病毒在細(xì)胞中的增殖需要宿主細(xì)胞核的參與。

脾臟是機(jī)體最大的免疫器官[17]，但對淋巴組織有嗜性的CSFV卻沒有在1 dpi脾臟中檢測到病毒RNA。首先脾臟是產(chǎn)生IgM的主要場所，在感染初期IgM對及時清除病毒發(fā)揮著關(guān)鍵作用，且脾臟中存在大量的自然殺傷細(xì)胞[18]、單核巨噬細(xì)胞[19]、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞[20]，這些免疫細(xì)胞在先天性免疫階段發(fā)揮著重要抗病毒作用；其次脾臟沒有輸入淋巴管，也沒有淋巴竇，不利于病毒隨淋巴循環(huán)進(jìn)入脾臟；這可能是本研究構(gòu)建的豬瘟亞急性感染早期脾臟中病毒RNA信號較弱不易檢出的原因。肺臟是CSFV嗜性較弱的器官，20 dpi后肺間質(zhì)充血明顯緩解，且病毒陽性信號減弱。CSFV在宿主體內(nèi)感染的靶細(xì)胞主要是骨髓源細(xì)胞[21]，如巨噬細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞能夠吸收大部分進(jìn)入呼吸道的顆粒物質(zhì)，但是它既不能夠遷移到相關(guān)的淋巴結(jié)[22]，也沒有抗原遞呈功能[23]，所以CSFV不易在肺臟中復(fù)制傳播。CSFV在體內(nèi)的靶細(xì)胞不僅有巨噬細(xì)胞，同時還有血管內(nèi)皮細(xì)胞[24]，CSFV侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞后導(dǎo)致血管通透性增加，因此在H.E染色中各組織出現(xiàn)以充血、出血、淤血為主的病理變化。CSFV對中胚層組織尤其是造血器官及血管有著特殊的親和力[25]，腎臟不是免疫器官，卻在1 dpi檢測到病毒RNA及蛋白，這可能與腎臟是中胚層分化而來的器官有關(guān)系[26]，病毒主要位于腎小管上皮及腎小球等具有分泌功能的部位。消化管與外界直接相連，病毒等病原微生物易隨著食物進(jìn)入消化系統(tǒng)，且胃腸黏膜組織中25%是淋巴組織，這有利于嗜免疫細(xì)胞的CSFV在消化系統(tǒng)中傳播復(fù)制。在胰腺的腺泡、十二指腸的腸絨毛及黏膜下層、回盲瓣的黏膜下層等具有分泌功能的部位同樣有大量病毒聚集。

結(jié)合以上分析發(fā)現(xiàn)，CSFV雖然是一種親免疫細(xì)胞的病毒，但是由于先天性免疫等因素，在亞急性感染早期，CSFV沒有在脾臟大量復(fù)制。同時這幾種組織在13 dpi時出現(xiàn)了病毒RNA及蛋白均明顯增多的現(xiàn)象，在豬瘟慢性感染病程中，病毒在前期同樣增長緩慢[27]，這是由于機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)發(fā)揮了重要作用。例如，CSFV感染能夠誘導(dǎo)IL-1β的釋放[28]，而IL-1可以引起機(jī)體發(fā)熱[29]，這或許也是感染早期體溫迅速升高的原因，而到了感染中期，宿主的白細(xì)胞數(shù)量明顯減少，造成對病毒的抑制作用減弱[30]，導(dǎo)致在13 dpi CSFV含量迅速增加。這進(jìn)一步說明在感染早期由于先天性免疫的作用，CSFV在脾臟的增殖復(fù)制存在一定阻力。從13 dpi后的病程中CSFV在各組織內(nèi)開始大量繁殖，并廣泛分布在組織內(nèi)的各個部位，CSFV不僅在像脾臟動脈周圍淋巴鞘等免疫細(xì)胞聚集區(qū)大量復(fù)制增殖，還會在胰腺的腺泡、腎臟的腎小管等具有分泌功能的結(jié)構(gòu)處增殖復(fù)制。

4 結(jié)論

采用優(yōu)化的CSFV ViewRNA ISH能在1 dpi檢測到豬瘟亞急性感染豬回盲瓣組織中的病毒RNA，較IHC能更早檢出病毒的存在；采用CSFV ViewRNA ISH、ICH方法對各個組織中病毒RNA進(jìn)行定位，結(jié)果與H.E染色檢測到的組織損傷部位一致，表明ViewRNA ISH具有較高的靈敏度，適用于感染早期CSFV在嗜性組織中RNA動態(tài)分布研究；研究還表明豬瘟亞急性感染早期病毒RNA通常在腺泡、腎小管等結(jié)構(gòu)及脾臟的橢圓體周圍復(fù)制，感染中期在各組織中廣泛分布且大量增殖，感染后期病毒主要富集在淋巴結(jié)和有分泌功能的部位，表明病毒對分泌結(jié)構(gòu)如腺泡也存在明顯嗜性。

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Dynamic Distribution of Classical Swine Fever Virusafter Infection by Intermediate Virulent Strains

SUN JunXiang1, ZHANG QianYi1, XU HeMin2, WANG TuanJie1, XU Lu1, ZOU XingQi1, ZHU YuanYuan1, LI Cui1, XIA YingJu1, XU Yuan1, CHEN Kai1, ZHANG YuJie1, ZHAO QiZu1, WANG Qin1

(1National/OIE Reference Laboratory for Classical Swine Fever, China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081;2China Animal Husbandry Industry Co., LTD, Beijing 100070)

【Objective】At present, the infection type of classical swine fever in China is mainly subacute or chronic infection. The aim of this study was to investigate the differences and distribution of RNA and protein expressions in pigs infected with the intermediate virulent strain of classical swine fever virus.The results couldhelp to elucidate the replication and distribution of the subacute disease virus and to provide technical support for the early diagnosis and prevention of classical swine fever.【Method】Using the medium virulence strain (HEBHH1/95), we successfully established a subacute CSF infection animal model. Duodenum, spleen, kidney, lung, pancreas and ileocecal samples were collected from pigs for viewing in situ hybridization (ISH), immunohistochemistry (IHC) and hematoxylin-eosin staining (HE) at 1 day post infection (dpi), 3 dpi, 6 dpi, 10 dpi, 13 dpi, 20 dpi, 24 dpi and 28 dpi. The ViewRNA ISH was used to study the dynamic distribution of viral RNA in infected tissues. Immunohistochemistry (IHC) and HE staining were used to detect the distribution of viral proteins in infected tissues and their contribution to tissue damage.【Result】The clinical score increased rapidly from 6 dpi to 10 dpi, then from 11 dpi to 26 dpi the score remained at approximately 15,until at 28 dpi clinical score peaked at 20 points. The body temperature showed an upward trend from 8 dpi to 10 dpi, and then livestock suffered from continuous fever which persisted at about 40℃from 13 dpi to 24 dpi, thereafter, the body temperature began to fall back to about 39.5℃before the animal died. Viral RNA were detected in duodenum, pancreas, ileocecal valve and kidney at 1 dpi and in the lungs of the bronchioles, spleen oval body at 3 dpi; Viral RNAs widely distributed in each tissue at 28 dpi, and were mainly observed in the spleen artery around the lymphatic sheath, pancreatic acinar, renal tubular with secretion function. The IHC and HE staining were used to verify the results of ViewRNA ISH in similar fields of vision. The positive signals of viral proteins and the corresponding histopathological changes of duodenum, pancreas and kidney were also detected at 1 dpi, but the viral protein and tissue pathological changes were detected in the ileocecal valve, spleen and lung at 3 dpi. Viral RNA and protein localization tended to be the same in each tissue after 3 dpi.【Conclusion】All the results showed that CSFV had an increasing virus load from 1 dpi to 28 dpi detected by ViewRNA ISH,which was in consistent with the result of IHC. Moreover, CSFV was firstly tropism to secretory cells such as pancreatic acinar, renal tubular and spleen artery at the beginning of infection (1 dpi-3 dpi), and then showed pantropically infectious to all the tissues during the infection period (6 dpi-13 dpi), and during the final stage CSFV was accumulated both around lymphocytes and secretory cells (20 dpi-28 dpi).

CSFV; medium virulent; RNA; ViewRNA ISH; distribution

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.21.013

2018-04-18；

2018-05-28

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題（2015BAD12B04）、“十三五”豬重要疫病抗體快速檢測技術(shù)研究（2016YFD0500702-4）

孫駿翔，E-mail：yixiao_xi@163.com；張乾義，E-mail：zhangqy114@126.com。孫駿翔和張乾義為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者王琴，E-mail：wq551@vip.sina.com。通信作者趙啟祖，E-mail：zhaoqizu@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）