利用胚挽救技術(shù)創(chuàng)制無(wú)核抗寒葡萄新種質(zhì)

趙雅楠，駱強(qiáng)偉，王躍進(jìn)

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利用胚挽救技術(shù)創(chuàng)制無(wú)核抗寒葡萄新種質(zhì)

趙雅楠1，駱強(qiáng)偉2，王躍進(jìn)1

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)試驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所，新疆鄯善 838201）

【目的】獲得無(wú)核抗寒葡萄新種質(zhì)并提高抗寒無(wú)核葡萄胚挽救育種效率。【方法】以7個(gè)雜交組合的胚珠作為試驗(yàn)材料，研究不同親本基因型、基本培養(yǎng)基類型（MM3和ER）、不同氨基酸（MM3+2.5 mmol·L-1半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸）對(duì)無(wú)核葡萄胚發(fā)育率和成苗率的影響。從雜交親本中分別利用無(wú)核探針GSLP1-569、SCC8-1018和抗寒的分子標(biāo)記S241-717，確定能擴(kuò)增出特異帶的親本，再用相應(yīng)的分子標(biāo)記對(duì)其雜種后代進(jìn)行無(wú)核和抗寒性狀的鑒定?！窘Y(jié)果】7個(gè)雜交組合接種至MM3培養(yǎng)基的胚珠為1 168個(gè)，獲得發(fā)育胚331個(gè)和雜種后代97株，雜交組合‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’的胚發(fā)育率和成苗率最高，分別為46.00%和17.33%。通過(guò)比較母本基因型，以‘雙優(yōu)’為父本，‘紅臉無(wú)核’‘無(wú)核白’‘昆香無(wú)核’為母本，雜交組合‘昆香無(wú)核’ב雙優(yōu)’獲得胚發(fā)育率和成苗率最高，分別為45.39%和16.31%；以‘北冰紅’為父本，‘紅臉無(wú)核’‘美麗無(wú)核’‘無(wú)核白’為母本，雜交組合‘紅臉無(wú)核’ב北冰紅’獲得胚發(fā)育率和成苗率最高，分別為33.52%和6.59%。父本基因型對(duì)胚挽救成苗有一定影響，‘紅臉無(wú)核’ב北冰紅’和‘紅臉無(wú)核’ב雙優(yōu)’，胚發(fā)育率分別為33.52%、39.00%，成苗率為6.59%、9.50%；‘無(wú)核白’ב北冰紅’和‘無(wú)核白’ב雙優(yōu)’的胚發(fā)育率分別為7.64%、19.26%，成苗率為1.91%、8.15%。接種至MM3培養(yǎng)基的胚珠，獲得的胚發(fā)育率和成苗率均高于ER培養(yǎng)基。雜交組合‘昆香無(wú)核’ב雙優(yōu)’的胚珠接種至添加2.5 mmol·L-1谷氨酰胺的MM3培養(yǎng)基，獲得胚發(fā)育率最高，為59.69%；添加天冬酰胺、谷氨酰胺培養(yǎng)的雜種胚珠獲得的成苗率分別為21.43%、20.93%，對(duì)成苗促進(jìn)作用顯著；對(duì)于雜交組合‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’，添加2.5 mmol·L-1天冬酰胺的胚發(fā)育率最高，為55.71%；添加天冬酰胺、谷氨酰胺培養(yǎng)的雜種胚珠的成苗率分別為21.43%、22.22%，對(duì)成苗促進(jìn)作用顯著。利用無(wú)核標(biāo)記GSLP-569、SCC8-1018和抗寒分子標(biāo)記S241-717，共檢測(cè)了6個(gè)雜交組合的83個(gè)雜種株系，其中攜帶無(wú)核分子標(biāo)記的雜種株系49個(gè)，抗寒分子標(biāo)記的雜種株系55個(gè)，同時(shí)攜帶無(wú)核和抗寒標(biāo)記的雜種株系36個(gè)?！窘Y(jié)論】‘昆香無(wú)核’和‘紅臉無(wú)核’適宜作為胚挽救育種的母本材料?！p優(yōu)’作為父本比‘北冰紅’的胚挽救效率更高。MM3適宜作為胚發(fā)育培養(yǎng)基。MM3培養(yǎng)基中添加酰胺類氨基酸可以促進(jìn)胚挽救成苗。分子標(biāo)記檢測(cè)的83個(gè)雜種株系中，36個(gè)雜種株系攜帶無(wú)核抗寒分子標(biāo)記。

無(wú)核葡萄；抗寒性；胚挽救；胚珠培養(yǎng)；分子標(biāo)記輔助選擇

0 引言

【研究意義】葡萄是世界范圍內(nèi)主要的果樹種類之一，占世界水果栽培總面積的14.1%[1-2]。無(wú)核葡萄因在鮮食和制干上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)而深受消費(fèi)者青睞，美國(guó)市場(chǎng)中的大部分鮮食葡萄和制干葡萄為無(wú)核品種[3-5]。一般利用傳統(tǒng)雜交育種培育無(wú)核葡萄只能采用有核×無(wú)核葡萄的方式進(jìn)行雜交，育種年限長(zhǎng)，無(wú)核后代效率低。胚挽救技術(shù)可將種子敗育型無(wú)核葡萄作母本，提高雜種后代無(wú)核率和育種效率。現(xiàn)栽培無(wú)核葡萄品種多為歐亞種（），品質(zhì)優(yōu)良，但抗寒性差。在中國(guó)北方地區(qū)冬季需埋土防寒，增加了成本[6]，每天達(dá)到625—1 000元/hm2[7]，耗時(shí)耗力。因此，利用胚挽救技術(shù)縮短育種年限，通過(guò)以無(wú)核葡萄作母本，抗寒性強(qiáng)的葡萄作父本，可提高選育出抗寒、優(yōu)質(zhì)無(wú)核葡萄的育種效率，進(jìn)而減少葡萄冬季埋土防寒的損耗，具有重要價(jià)值[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1982年，Ramming等[8]首次報(bào)道利用改良的White培養(yǎng)基培養(yǎng)無(wú)核葡萄胚珠，獲得兩株實(shí)生苗。此后，Emmershad等[9-10]繼續(xù)深入研究基因型、取樣時(shí)期、培養(yǎng)基及其相互作用對(duì)無(wú)核葡萄胚珠內(nèi)培養(yǎng)的影響，建立了輔助無(wú)核葡萄育種的胚挽救技術(shù)程序。親本基因型的篩選與離體培養(yǎng)基的組成是提高育種效率的重要因素，如何提高成苗率和育種效率仍然是胚挽救育種的重要課題[11]。目前篩選出的優(yōu)良品種或品系，親本多為歐洲葡萄[4-5,12-13]，突出問(wèn)題是抗寒性差?？购允鞘芏鄶?shù)基因控制的數(shù)量性狀，葡萄屬植物全部19對(duì)染色體上均承擔(dān)同等分量的抗寒值。我國(guó)抗寒葡萄育種始于1952年，主要以山葡萄作為歐亞種或歐美雜種導(dǎo)入優(yōu)良品質(zhì)的親本[14]。中國(guó)野生葡萄中的一些種或株系抗寒性強(qiáng)，可作為抗寒無(wú)核葡萄胚挽救育種的重要種質(zhì)資源?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】從胚挽救影響的因素出發(fā)，配置無(wú)核品種×抗寒品種的雜交組合；優(yōu)化胚發(fā)育基本培養(yǎng)基，對(duì)雜種后代進(jìn)行早期無(wú)核、抗寒性狀的輔助篩選?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)比較親本基因型和對(duì)胚發(fā)育培養(yǎng)基的篩選與優(yōu)化，提高無(wú)核葡萄品種胚挽救效率。同時(shí)將中國(guó)野生葡萄和歐山雜種葡萄抗寒性基因融入到無(wú)核品種中，篩選攜帶無(wú)核和抗寒標(biāo)記的胚挽救苗，以期獲得抗寒性強(qiáng)的無(wú)核新種質(zhì)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年4月至2018年4月在新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所、旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和西北農(nóng)林科技大學(xué)種質(zhì)資源圃完成。

1.1 試驗(yàn)材料

以種子敗育型無(wú)核品種‘昆香無(wú)核’‘無(wú)核白’‘紅臉無(wú)核’‘美麗無(wú)核’及‘紅寶石無(wú)核’為母本。以抗寒性較強(qiáng)的山葡萄‘雙優(yōu)’（‘雙慶’ב左山一’）、歐山雜種‘北冰紅’（‘左優(yōu)紅’× 84-26-53）和‘北醇’（‘玫瑰香’ב山葡萄’）為父本。雜交組合配置詳見(jiàn)表1。

表1 雜交組合配置

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 胚挽救技術(shù)的基本操作流程 選擇長(zhǎng)勢(shì)健壯的母本及結(jié)果母枝，對(duì)發(fā)育良好的花序去雄。去雄后套袋標(biāo)記。待柱頭出現(xiàn)透明黏液時(shí)進(jìn)行人工授粉。連續(xù)授粉2—3次，每次間隔24 h。根據(jù)母本的授粉日期，采集雜交果實(shí)。

胚挽救程序參照唐冬梅[1]的方法進(jìn)行。將長(zhǎng)度＞2 mm的部分胚珠接種于發(fā)育培養(yǎng)基中，所用的發(fā)育培養(yǎng)基為MM3+60 g·L-1蔗糖+0.5 g·L-1水解酪蛋白+0.1 g·L-1肌醇+3 g·L-1活性炭+7 g·L-1瓊脂，每個(gè)容器接種15粒胚珠，其余胚珠用于不同組分的發(fā)育培養(yǎng)基試驗(yàn)。暗培養(yǎng)10周后，無(wú)菌條件下剖取胚，接種至胚萌發(fā)培養(yǎng)基（WPM+20 g·L-1蔗糖+0.2 mg·L-16-BA+0.1 g·L-1肌醇+1 g·L-1活性炭+7 g·L-1瓊脂）上。光照過(guò)程中統(tǒng)計(jì)不同組合發(fā)育胚的個(gè)數(shù)和正常成苗數(shù)，計(jì)算最終的胚發(fā)育率和成苗率，參考屈田田[15]的方法。

1.2.2 胚發(fā)育基本培養(yǎng)基對(duì)胚挽救的影響 ‘無(wú)核白’ב雙優(yōu)’和‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’的胚珠接種于ER或MM3培養(yǎng)基，比較基本培養(yǎng)基對(duì)胚挽救的影響。所用ER培養(yǎng)基和MM3培養(yǎng)基的主要成分參考文獻(xiàn)[6]。每種培養(yǎng)基接種40—50粒胚珠，重復(fù)3次。

1.2.3 胚發(fā)育培養(yǎng)基中添加不同氨基酸對(duì)胚挽救的影響 以雜交組合‘昆香無(wú)核’ב雙優(yōu)’和‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’雜交后的胚珠接種于MM3基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基內(nèi)分別添加2.5 mmol·L-1的半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和絲氨酸，以不添加氨基酸的MM3培養(yǎng)基為對(duì)照。

上述培養(yǎng)基采用固體形式。每種處理接種30—150粒胚珠，重復(fù)3次。

1.2.4 雜交后代無(wú)核、抗寒性狀的早期檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[6]的方法，提取雜交后代株系基因組DNA，使用無(wú)核標(biāo)記GLSP1-569、SCF27-2000和SCC8-1018，抗寒標(biāo)記S241-717進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)核抗寒葡萄胚挽救雜交組合成苗及基因型對(duì)胚挽救成苗的影響

2.1.1 無(wú)核抗寒葡萄胚挽救雜交組合成苗情況 2017年共配置7個(gè)雜交組合，其中1 168個(gè)胚珠接種于MM3胚發(fā)育培養(yǎng)基中，獲得發(fā)育胚331個(gè)，成苗97株。雜交組合‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’的胚發(fā)育率和成苗率均最高，分別為46.00%和17.33%（表2）。

2.1.2 不同母本基因型對(duì)胚挽救成苗的影響 以‘雙優(yōu)’為父本，‘昆香無(wú)核’‘無(wú)核白’‘紅臉無(wú)核’為母本的雜交組合的胚發(fā)育率分別為45.39%、19.26%、39.00%，成苗率分別為16.31%、8.15%、9.50%，‘昆香無(wú)核’ב雙優(yōu)’的胚發(fā)育率和成苗率最高；以‘北冰紅’為父本，‘美麗無(wú)核’‘無(wú)核白’‘紅臉無(wú)核’為母本的雜交組合的胚發(fā)育率分別為10.34%、7.64%、33.52%，成苗率為1.48%、1.91%、6.59%，‘紅臉無(wú)核’ב北冰紅’的胚發(fā)育率和成苗率最高。結(jié)果表明，‘昆香無(wú)核’與‘紅臉無(wú)核’適宜作為胚挽救母本（表2）。

2.1.3 不同父本基因型對(duì)胚挽救成苗的影響 在以‘紅臉無(wú)核’為母本的兩個(gè)雜交組合‘紅臉無(wú)核’ב北冰紅’和‘紅臉無(wú)核’ב雙優(yōu)’中，胚發(fā)育率分別為33.52%、39.00%，成苗率分別為6.59%、9.50%；以‘無(wú)核白’為母本的雜交組合‘無(wú)核白’ב北冰紅’和‘無(wú)核白’ב雙優(yōu)’的胚發(fā)育率分別為7.64%、19.26%，成苗率為1.91%、8.15%。因此，‘雙優(yōu)’要優(yōu)于以‘北冰紅’作為父本的胚挽救效率（表2）。

2.2 不同培養(yǎng)基組分對(duì)胚挽救成苗的影響

2.2.1 基本培養(yǎng)基對(duì)胚挽救效率的影響 ‘無(wú)核白’ב雙優(yōu)’和‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’的胚珠分別接種到MM3或ER基本培養(yǎng)基。結(jié)果表明，接種至MM3培養(yǎng)基所獲得的胚發(fā)育率和成苗率均顯著高于ER培養(yǎng)基（表3），說(shuō)明MM3培養(yǎng)基更有利于胚的發(fā)育和成苗。

表2 雜交組合胚挽救成苗情況

以上所有雜交組合胚珠均接種于MM3發(fā)育培養(yǎng)基中 Ovules of combinations all above are cultured in MM3 medium

2.2.2 不同氨基酸對(duì)胚挽救效率的影響 對(duì)于雜交組合‘昆香無(wú)核’ב雙優(yōu)’，在MM3培養(yǎng)基中添加2.5 mmol·L-1谷氨酰胺的胚發(fā)育率最高達(dá)59.69%，顯著高于對(duì)照45.39%，說(shuō)明谷氨酰胺能促進(jìn)該組合胚的發(fā)育。添加天冬酰胺和絲氨酸的胚發(fā)育率（47.86%和53.33%）雖高于對(duì)照，但無(wú)顯著性差異。添加天冬酰胺、谷氨酰胺培養(yǎng)的雜種胚珠獲得的成苗率分別為21.43%、20.93%，顯著高于對(duì)照16.31%，說(shuō)明天冬酰胺、谷氨酰胺對(duì)該組合成苗均具有促進(jìn)作用（表3）。

對(duì)于雜交組合‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’，添加2.5 mmol·L-1天冬酰胺的胚發(fā)育率最高達(dá)55.71%，顯著高于對(duì)照46.00%，說(shuō)明天冬酰胺對(duì)該組合胚發(fā)育具有促進(jìn)作用。添加天冬酰胺、谷氨酰胺培養(yǎng)的雜種胚珠獲得的成苗率分別為21.43%、22.22%，顯著高于對(duì)照17.33%，說(shuō)明兩種氨基酸均能促進(jìn)‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’的成苗。添加谷氨酰胺的‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’雜交子代成苗率最高，其成苗根系發(fā)達(dá)，葉色濃綠，植株莖端粗壯，長(zhǎng)勢(shì)較好（圖1-D）。添加半胱氨酸的成苗率為11.49%，顯著低于對(duì)照，對(duì)該組合的成苗具有抑制作用（表3）。

上述試驗(yàn)證明，不同氨基酸對(duì)兩個(gè)雜交組合的胚發(fā)育和成苗影響略有差異。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)添加了酰胺類物質(zhì)的培養(yǎng)基對(duì)兩種組合的成苗均有顯著促進(jìn)作用，兩種組合成苗率均達(dá)20%以上。

2.3 雜交親本的無(wú)核、抗寒性狀檢測(cè)

2.3.1 不同無(wú)核標(biāo)記對(duì)雜交親本的檢測(cè) 利用3種無(wú)核標(biāo)記對(duì)8個(gè)雜交親本品種進(jìn)行PCR分析的分子標(biāo)記檢測(cè)。無(wú)核基因探針GSLP1-569的檢測(cè)結(jié)果表明，‘無(wú)核白’攜帶無(wú)核分子標(biāo)記，其余親本未擴(kuò)增出特異條帶。因此無(wú)核基因探針GSLP1-569可用于雜交組合‘無(wú)核白’ב北冰紅’和‘無(wú)核白’ב雙優(yōu)’的雜種鑒定（圖2-A）；無(wú)核標(biāo)記SCF27-2000的檢測(cè)結(jié)果中，母本‘紅臉無(wú)核’‘美麗無(wú)核’‘昆香無(wú)核’‘紅寶石無(wú)核’與父本有核品種‘北冰紅’‘雙優(yōu)’‘北醇’都具有2 000 bp特異條帶，該標(biāo)記不適用于對(duì)本試驗(yàn)雜交后代早期無(wú)核性狀的鑒定（圖2-B）；無(wú)核標(biāo)記SCC8-1018檢測(cè)結(jié)果中，母本‘昆香無(wú)核’‘美麗無(wú)核’‘紅臉無(wú)核’攜帶無(wú)核標(biāo)記，適用于對(duì)組合‘昆香無(wú)核’ב雙優(yōu)’‘美麗無(wú)核’ב北冰紅’‘紅臉無(wú)核’ב北冰紅’‘紅臉無(wú)核’ב雙優(yōu)’的雜種進(jìn)行早期無(wú)核性狀的檢測(cè)。‘紅寶石無(wú)核’和父本有核品種‘北醇’攜帶無(wú)核標(biāo)記，不適用對(duì)雜交組合‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’的雜種后代篩選（圖2-C）。

表3 不同發(fā)育培養(yǎng)基組分對(duì)不同雜交組合胚挽救成苗的影響

不同小寫字母代表在＜0.05 水平上差異顯著 Means with different lowercases indicate significantly different at＜0.05 level

2.3.2 抗寒標(biāo)記S241-717對(duì)雜交親本的檢測(cè) 抗寒標(biāo)記S241-717對(duì)8個(gè)雜交親本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，父本‘北冰紅’和‘雙優(yōu)’在717 bp處擴(kuò)增出特異條帶。因此可用于以‘北冰紅’和‘雙優(yōu)’為父本的雜交組合的雜交子代早期抗寒性狀初步鑒定（圖2-D）。

A：MM3；B—E：MM3+2.5 mmol·L-1半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸MM3+2.5 mmol·L-1 cysteine, asparagine, glutamine, serine

A：無(wú)核探針GSLP1-569 The probe of GSLP1-569 linked to seedlessness gene；B：無(wú)核標(biāo)記SCF27-2000 The molecular marker of SCF27-2000 linked to seedlessness gene；C：無(wú)核標(biāo)記SCC8-1018 The molecular marker of SCC8-1018 linked to seedlessness gene；D：抗寒標(biāo)記S241-717 The molecular marker of S241-717 linked to the hardiness gene；M：Marker (DL2000Plus)；1：昆香無(wú)核Kunxiang Seedless；2：美麗無(wú)核Beauty Seedless；3：無(wú)核白Thompson Seedless；4：紅臉無(wú)核Blush Seedless；5：紅寶石無(wú)核Ruby Seedless；6：北冰紅Beibinghong；7：雙優(yōu)Shuangyou；8：北醇Beichun；“+”表示特異條帶出現(xiàn)，“-”表示特異條帶不出現(xiàn)，下同“+” indicates this material DNA contains specific band and “-” indicates this material DNA contains no specific band. The same as below

2.4 利用不同分子標(biāo)記對(duì)雜交后代無(wú)核、抗寒性狀鑒定

2.4.1 無(wú)核基因探針GSLP1-569和抗寒標(biāo)記S241-717對(duì)雜交后代的檢測(cè) 無(wú)核探針GSLP1-569對(duì)‘無(wú)核白’ב北冰紅’3個(gè)雜交后代的DNA擴(kuò)增結(jié)果中，株系C-1和C-3具有569 bp的特異性條帶（圖3-A）。抗寒標(biāo)記S241-717對(duì)‘無(wú)核白’ב北冰紅’后代的擴(kuò)增結(jié)果中，株系C-1和C-2擴(kuò)增出717 bp特異性條帶（圖3-B）。同擴(kuò)增出無(wú)核和抗寒特異性條 帶的株系為C-1（圖3-A、3-B）。

利用無(wú)核基因探針GSLP1-569對(duì)‘無(wú)核白’ב雙優(yōu)’16個(gè)雜交后代進(jìn)行檢測(cè)，其中10個(gè)株系擴(kuò)增出569 bp的特異性條帶（圖4-A）。利用抗寒基因標(biāo)記S241-717對(duì)‘無(wú)核白’ב雙優(yōu)’雜交后代進(jìn)行檢測(cè)，有9個(gè)株系擴(kuò)增出特異性條帶（圖4-B）。篩選出同時(shí)具有無(wú)核和抗寒特異性條帶的株系7個(gè)，編號(hào)為D-3、D-4、D-6、D-8、D-9、D-10、D-16（圖4-A、4-B）。

A：無(wú)核探針GSLP1-569 The probe of GSLP1-569 linked to seedlessness gene；B：抗寒標(biāo)記S241-717 The molecular marker of S241-717 linked to the hardiness gene；M：Marker (DL2000Plus)；1：無(wú)核白Thompson Seedless；2：北冰紅Beibinghong；3：C-1；4：C-2；5：C-3

A：無(wú)核探針GSLP1-569 The probe of GSLP1-569 linked to seedlessness gene；B：抗寒標(biāo)記S241-717 The molecular marker of S241-717 linked to the hardiness gene；M：Marker (DL2000Plus)；1：無(wú)核白Thompson Seedless；2：雙優(yōu)Shuangyou；3：D-1；4：D-2；5：D-3；6：D-4；7：D-5；8：D-6；9：D-7；10：D-8；11：D-9；12：D-10；13：D-11；14：D-12；15：D-13；16：D-14；17：D-15；18：D-16

2.4.2 無(wú)核基因標(biāo)記SCC8-1018和抗寒基因標(biāo)記S241-717對(duì)雜交后代檢測(cè) 無(wú)核標(biāo)記SCC8-1018對(duì)‘紅臉無(wú)核’ב北冰紅’12個(gè)雜交后代進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果表明，4個(gè)株系擴(kuò)增出特異性條帶（圖5-A）。抗寒基因標(biāo)記S241-717對(duì)該組合雜交后代的擴(kuò)增結(jié)果中，具有特異性條帶的株系7個(gè)（圖5-B）。篩選出同時(shí)具有無(wú)核和抗寒特異性條帶的株系3個(gè)，編號(hào)為F-5、F-6和F-10（圖5-A、5-B）。

無(wú)核標(biāo)記SCC8-1018對(duì)‘紅臉無(wú)核’ב雙優(yōu)’的19個(gè)雜交后代進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，10個(gè)株系擴(kuò)增出特異性條帶（圖6-A）?？购驑?biāo)記S241-717對(duì)該組合雜交后代的擴(kuò)增結(jié)果表明，15個(gè)株系具有特異性條帶（圖6-B）。篩選出同時(shí)具有無(wú)核和抗寒特異性條帶的株系9個(gè)，編號(hào)為G-2、G-3、G-5、G-8、G-10、G-11、G-13、G-16、G-19（圖6-A、6-B）。

無(wú)核基因標(biāo)記SCC8-1018和抗寒基因標(biāo)記S241- 717檢測(cè)的‘美麗無(wú)核’ב北冰紅’3個(gè)雜交后代均兼有無(wú)核和抗寒的特異性條帶，后代得到的無(wú)核、抗寒雜交率100%（圖7-A、7-B）。

無(wú)核標(biāo)記SCC8-1018 對(duì)‘昆香無(wú)核’ב雙優(yōu)’的30個(gè)雜交后代檢測(cè)結(jié)果表明，20個(gè)株系擴(kuò)增出特異性條帶（圖8-A）?？购驑?biāo)記S241-717對(duì)子代的檢測(cè)結(jié)果表明，19個(gè)株系具有特異性條帶（圖8-B）。同時(shí)篩選出具有無(wú)核和抗寒特異性條帶的株系13個(gè)，編號(hào)為A-3、A-5、A-6、A-7、A-9、A-10、A-13、A-14、A-15、A-16、A-19、A-24、A-26（圖8-A、8-B）。

A：無(wú)核標(biāo)記SCC8-1018 The molecular marker of SCC8-1018 linked to seedlessness gene；B：抗寒標(biāo)記S241-717 The molecular marker of S241-717 linked to the hardiness gene；M：Marker (DL2000Plus)；1：紅臉無(wú)核Blush Seedless；2：北冰紅Beibinghong；3：F-1；4：F-2；5：F-3；6：F-4；7：F-5；8：F-6；9：F-7；10：F-8；11：F-9；12：F-10；13：F-11；14：F-12

A：無(wú)核標(biāo)記SCC8-1018 The molecular marker of SCC8-1018 linked to seedlessness gene；B：抗寒標(biāo)記S241-717 The molecular marker of S241-717 linked to the hardiness gene；M：Marker (DL2000)；1：紅臉無(wú)核Blush Seedless；2：雙優(yōu)Shuangyou；3：G-1；4：G-2；5：G-3；6：G-4；7：G-5；8：G-6；9：G-7；10：G-8；11：G-9；12：G-10；13：G-11；14：G-12 15：G-13；16：G-14； 17：G-15；18：G-16；19：G-17；20：G-18；21：G-19

A：無(wú)核標(biāo)記SCC8-1018 The molecular marker of SCC8-1018 linked to seedlessness gene；B：抗寒標(biāo)記S241-717 The molecular marker of S241-717 linked to the hardiness gene；M：Marker (DL2000Plus)；1：美麗無(wú)核Beauty Seedless；2：北冰紅Beibinghong；3：B-1；4：B-2；5：B-3

A：無(wú)核標(biāo)記SCC8-1018 The molecular marker of SCC8-1018 linked to seedlessness gene；B：抗寒標(biāo)記S241-717 The molecular marker of S241-717 linked to the hardiness gene；M：Marker (DL2000)；1：昆香無(wú)核Kunxiang Seedless；2：雙優(yōu)Shuangyou；3：A-1；4：A-2；5：A-3；6：A-4；7：A-5；8：A-6；9：A-7；10：A-8；11：A-9；12：A-10；13：A-11；14：A-12；15：A-13；16：A-14；17：A-15；18：.A-16；19：A-17；20：A-18；21：A-19；22：A-20；23：A-21；24：A-22；25：A-23；26：A-24；27：A-25；28：A-26；29：A-27；30：A-28；31：A-29；32：A-30

3 討論

提高無(wú)核葡萄胚挽救的主要影響因素包括親本基因型、培養(yǎng)基、取樣時(shí)期、培養(yǎng)方式等。親本間雜交的親和力對(duì)胚挽救成苗具有重要作用[16]。本研究中雜交組合‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’獲得成苗率最高，可能是由于親本之間親和性強(qiáng)，有利于合子胚的形成和萌發(fā)。雜交無(wú)核葡萄胚的發(fā)育很大程度上受到母本基因型的影響[17-20]，不同種子敗育型的無(wú)核葡萄中合子胚的形成能力有著較大的差異[15]。已有資料顯示，胚敗育發(fā)生過(guò)早或可挽救性差的品種如‘無(wú)核白’‘火焰無(wú)核’‘奇妙無(wú)核’等不宜用作母本材料[21-22]，而成苗率較高的品種如‘紅寶石無(wú)核’‘紅臉無(wú)核’‘底萊特’等適宜作為胚挽救的母本材料[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)以‘昆香無(wú)核’‘紅臉無(wú)核’為母本的雜交組合獲得的成苗率高于以‘無(wú)核白’‘美麗無(wú)核’為母本的雜交組合，推測(cè)原因可能與‘昆香無(wú)核’‘紅臉無(wú)核’合子胚的發(fā)育程度較高有關(guān)。

歐洲葡萄抗寒性差，不利于培育抗寒性強(qiáng)的無(wú)核葡萄新品種[16]。利用中國(guó)野生葡萄較強(qiáng)的抗寒性，通過(guò)胚挽救技術(shù)將其抗寒性基因?qū)霘W洲無(wú)核葡萄是一個(gè)有效策略。本研究父本材料山葡萄‘雙優(yōu)’、歐山雜種‘北冰紅’‘北醇’是通過(guò)常規(guī)雜交選育出的具有強(qiáng)抗寒性和高商品性的品種[25-27]。對(duì)以‘北冰紅’‘雙優(yōu)’為父本，相同母本雜交后獲得子代的成苗率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)‘雙優(yōu)’作為父本的胚挽救效率更高。說(shuō)明父本基因型對(duì)胚挽救效率有一定影響，基因型差異導(dǎo)致親本之間的親和力不同。

胚發(fā)育培養(yǎng)基為離體胚珠提供了幼胚發(fā)育所需的激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，直接影響到胚能否存活和進(jìn)一步發(fā)育，因此胚發(fā)育培養(yǎng)基是胚挽救成功的關(guān)鍵因素之一。1994年，Emershed等[10]創(chuàng)造的ER培養(yǎng)基在胚珠離體培養(yǎng)上取得了較好效果。但潘學(xué)軍[4]認(rèn)為以“無(wú)核品種×中國(guó)野生葡萄”組合為材料的胚挽救不適合以ER為基本培養(yǎng)基，并通過(guò)測(cè)定無(wú)核葡萄品種胚敗育前漿果中的大量元素含量配制出了MM3培養(yǎng)基，后續(xù)結(jié)果表明MM3培養(yǎng)基的效果更優(yōu)。本研究將‘無(wú)核白’ב雙優(yōu)’和‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’的雜種胚珠分別接種至MM3和ER培養(yǎng)基中，用MM3作為胚發(fā)育培養(yǎng)基的胚發(fā)育率和成苗率均優(yōu)于用ER培養(yǎng)基，結(jié)果與潘學(xué)軍的結(jié)論一致[4]，MM3培養(yǎng)基具有較高濃度的鎂離子和鉀離子，鉀離子是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必要營(yíng)養(yǎng)元素，推測(cè)提高鉀離子濃度有可能會(huì)促進(jìn)無(wú)核葡萄葡萄胚的發(fā)育，鎂離子在植物中主要與光合作用有關(guān)，而較高濃度的鎂離子可能會(huì)促進(jìn)胚挽救成苗。

氨基酸的種類對(duì)胚的發(fā)育和成苗會(huì)產(chǎn)生不同影響。Emershed等研究認(rèn)為谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸、絲氨酸可促進(jìn)胚的發(fā)育[9-10,13]。由于‘昆香無(wú)核’ב雙優(yōu)’‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’胚發(fā)育率和成苗率最高，因此用其胚珠作為氨基酸對(duì)胚挽救效率影響的試驗(yàn)材料。本研究用MM3作為基本培養(yǎng)基添加上述4種氨基酸對(duì)‘昆香無(wú)核’ב雙優(yōu)’‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’處理得到的結(jié)果不盡相同。谷氨酰胺促進(jìn)組合‘昆香無(wú)核’ב雙優(yōu)’胚的發(fā)育，而天冬酰胺對(duì)組合‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’胚的發(fā)育具有促進(jìn)作用，說(shuō)明不同氨基酸的處理對(duì)雜交組合的作用會(huì)有差異。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育培養(yǎng)基添加天冬酰胺、谷氨酰胺后對(duì)兩個(gè)組合成苗均起到促進(jìn)作用，與田莉莉[20]在不同品種的研究結(jié)果類似。同時(shí)研究認(rèn)為谷氨酰胺不僅提高了‘紅寶石無(wú)核’ב北醇’的成苗率，也促進(jìn)其成苗長(zhǎng)勢(shì)。但對(duì)于不同雜交組合胚珠的培養(yǎng)，需通過(guò)試驗(yàn)獲得其最適宜的胚發(fā)育培養(yǎng)基和成苗途徑[28]。

無(wú)核抗寒葡萄胚挽救育種過(guò)程中，通過(guò)胚挽救技術(shù)獲得雜種后代后，可選用無(wú)核和抗寒的分子標(biāo)記對(duì)雜交子代進(jìn)行輔助選擇，加快所篩選雜種進(jìn)入結(jié)果期，降低育種成本。目前用于無(wú)核性狀標(biāo)記輔助的有SCC8-1018、SCF27-2000、GSLP1-569、VMCF7F2-198和p3-VvAGL11-1200[29-33]。本研究利用親本對(duì)3種無(wú)核標(biāo)記SCC8-1018、SCF27-2000、GSLP1-569進(jìn)行了篩選，得到SCC8-1018可用于對(duì)‘美麗無(wú)核’ב北冰紅’‘紅臉無(wú)核’ב北冰紅’‘紅臉無(wú)核’ב雙優(yōu)’‘昆香無(wú)核’ב雙優(yōu)’4個(gè)雜交組合所獲得的雜種后代進(jìn)行早期無(wú)核性狀的輔助選擇；GSLP1-569可用于對(duì)雜交組合‘無(wú)核白’ב北冰紅’‘無(wú)核白’ב雙優(yōu)’的雜種后代早期無(wú)核性狀的輔助選擇。同時(shí)應(yīng)用抗寒標(biāo)記S241-717對(duì)上述雜交組合所獲得的后代進(jìn)行了早期抗寒性狀的輔助選擇。經(jīng)檢測(cè)6個(gè)雜交組合的83個(gè)雜種后代中，存在無(wú)核特異性條帶的子代為49個(gè)，抗寒特異性條帶的子代為55個(gè)，同時(shí)篩選出無(wú)核和抗寒特異性條帶的子代36個(gè)。初步篩選獲得了36個(gè)無(wú)核抗寒新種質(zhì)。

4 結(jié)論

不同的親本基因型對(duì)胚挽救成苗的影響不同，以‘紅寶石無(wú)核’‘昆香無(wú)核’‘紅臉無(wú)核’作為母本和以‘雙優(yōu)’作為父本的雜交組合胚挽救效率較高。MM3作為基本培養(yǎng)基有利于幼胚的發(fā)育和成苗；MM3培養(yǎng)基+酰胺類氨基酸可以促進(jìn)胚挽救成苗。分子標(biāo)記檢測(cè)的6個(gè)雜交組合83個(gè)雜種后代中，同時(shí)攜帶無(wú)核和抗寒分子標(biāo)記的雜種后代36個(gè)，這些雜種后代是今后田間雜種鑒定與觀測(cè)的重要對(duì)象，再結(jié)合葡萄抗寒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，觀察無(wú)核及抗寒性狀的表現(xiàn)，從中選出符合育種目標(biāo)的優(yōu)株。

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Breeding for Grape Germplasm involved in Seedlessness with Cold-resistant Using Embryo Rescue

ZHAO YaNan1, LUO QiangWei2, WANG YueJin1

(1College of Horticulture, Northwest Agriculture and Forestry University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas/Key Laboratory of Horticultural Plant Germplasm Resource Utilization in Northwest China, Ministry of Agriculture, Yangling 712100, Shaanxi;2Development and Research Centre of Grapes and Melons of Xinjiang Uighur Autonomous Region, Shanshan 838201, Xinjiang)

【Objective】 The objective of this study is to obtain new cold-resistant seedless grape germplasm and improve the breeding efficiency through embryo rescue. 【Method】The different genotypes, basal culture media (MM3 and ER), amino acids (2.5 mmol·L-1cysteine, asparagine, glutamine and serine were addedin MM3 medium) were used to investigate the effect on the embryo development rates and seedling rates from ovules of 7 cross combinations. From the parents, the molecular markers GSLP1-569 and SCC8-1018 for seedlessness and the marker S241-717 for cold-resistance were used to identify the strains with specific bands, and then the three markers were used to screen the hybrids by recognizing the specific bands. 【Result】 Of the 7 combinations, 1 168 ovules cultured in MM3 were obtained 331 embryos and 97 hybrid strains. Among these crosses, ‘Ruby Seedless’ × ‘Beichun’ got the highest embryo development rate and seedling rate, which were 46.00% and 17.33%, respectively. Compared with female parents, for ‘Shuangyou’ as male parent and ‘Blush Seedless’ ‘Thompson Seedless’ ‘Kunxiang Seedless’ as female parents, ‘Kunxiang Seedless’ × ‘Shuangyou’ had the highest embryo development rate and seedling rate, which were 45.39% and 16.31%, respectively. For ‘Beibinghong’ as male parent and ‘Blush Seedless’ ‘Beauty Seedless’ ‘Thompson Seedless’ as female parents, ‘Blush Seedless’ × ‘Beibinghong’ had the highest embryo development rate and seedling rate, which were 33.52% and 6.59%, respectively. Different male parents also influenced seedlings formation. the embryo development rates of ‘Blush Seedless’ × ‘Beibinghong’ and ‘Blush Seedless’ × ‘Shuangyou’ were 33.52% and 39.00%, and the seedling rates of them were 6.59% and 9.50%, respectively. the embryo development rates of ‘Thompson Seedless’ × ‘Beibinghong’ and ‘Thompson Seedless’ × ‘Shuangyou’ were 7.64% and 19.26%, and the seedling rates of them were 1.91% and 8.15%, respectively. The rate of embryo development and seedling of ovule cultured in MM3 medium was higher than that of ER medium. For ‘Kunxiang Seedless’ × ‘Shuangyou’, the ovules cultured in MM3 medium with 2.5 mmol·L-1glutamine showed the highest embryo development rate, which was 59.69%. The seedling rate of ovules cultured in basal media with asparagine and glutamine was 21.43% and 20.93%, respectively. The effect of promoting seedlings development was significant. For ‘Ruby Seedless’ × ‘Beichun’, the ovules in media with 2.5 mmol·L-1asparagine showed the highest embryo development rate, which was 55.71%. The seedling rate of ovules cultured in basal media with asparagine and glutamine was 21.43% and 22.22%, respectively. The effect of promoting seedlings development was significant. By using the molecular markers GSLP1-569 and SCC8-1018 for seedlessness and the marker S241-717 for cold-resistance, 83 hybrid strains from 6 cross combinations were detected, and there were 49 strains with specific bands of the molecular markers linked to the seedlessness, 55 strains with specific bands of the markers S241-717 for cold-resistance. Importantly, 36 strains with both seedlessness and cold-resistance were identified in this study. 【Conclusion】‘Kunxiang Seedless’ and ‘Blush Seedless’ are suitable as the female parents for embryo rescueof seedless grapes. The embryo rescue efficiency of ‘Shuangyou’ as the male parent is higher than that of ‘Beibinghong’. MM3 is suitable for embryo rescue, and the addition of amide acids to MM3 culture medium is helpful to the seedling formation. Among the 83 hybrid strains detected by molecular markers, 36 strains may have the seedless and cold-resistant characteristics.

seedless grape; cold-resistant; embryo-rescue; ovule culture; molecular marker assisted selection

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.21.010

2018-05-07；

2018-07-03

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)基金（CARS-29-yz-3）

趙雅楠，E-mail：zhaoyanan94@163.com。通信作者王躍進(jìn)，Tel：029-87082522；E-mail：wangyj@nwsuaf.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）