多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)XZ-2發(fā)酵條件優(yōu)化的研究

王 波,王 幸,周興根,黃忠勤,丁震乾,常 勇,周澗楠,蘇在興

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇 徐州 221131)

多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)是一種產(chǎn)芽孢的G+細(xì)菌,由于其具有植物病害防治、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、對(duì)人和動(dòng)植物無(wú)致病性并且無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)而受到重視,美國(guó)環(huán)保署(EPA)將其列為可在商業(yè)上推廣應(yīng)用的微生物之一[1],我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將其列為免做安全鑒定的一級(jí)菌種[2]。近年來(lái),關(guān)于多粘類芽孢桿菌用于植物病害生物防治的報(bào)道越來(lái)越多,例如：胡飛等研究發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌對(duì)水稻紋枯病有較好的防治效果[3];李峰等篩選到1株對(duì)小麥赤霉病菌有抑制作用的多粘類芽孢桿菌菌株[4];林營(yíng)志等篩選并鑒定了4株生防多粘類芽孢桿菌,其中菌株FJAT-4539對(duì)香蕉枯萎病有很強(qiáng)的抑制作用[5];宋順華等發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌對(duì)西瓜枯萎病具有較好的防治效果[6-7]。多粘類芽孢桿菌XZ-2是本課題組從江蘇省徐州市銅山區(qū)班井村大豆植株中分離篩選出的,該菌株具有廣譜抗真菌活性,對(duì)多種病原菌如大蒜葉枯病菌[Pleosporaherbarum(Pers.ex Fr.) Rabenk]、黃瓜灰霉病菌(Botrytiscinerea)、甘薯黑斑病菌(CeratocystisfimbriataEllis et Halsted)、絲瓜炭疽病菌(Colletotrichumorbiculare)、甜瓜枯萎病菌[Fusariumoxysporum(Schl.) f. sp.melonis]、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、小麥紋枯病菌(RhizoctoniacerealisVander Hoeven)、棉花黃萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb)、大豆疫霉病原菌(Phytophthorasojae)、大豆炭疽病原菌(Soybeananthracnose)、大豆菌核病原菌[Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary]等均具有較強(qiáng)的抑菌活性(另文發(fā)表)。基于該菌株的廣譜抗菌活性,我們初步認(rèn)為該生防菌株具有較好的應(yīng)用前景。本文采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法,對(duì)多粘類芽孢桿菌菌株XZ-2的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究,以期為該生防菌株的大規(guī)模生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

多粘類芽孢桿菌XZ-2從江蘇省徐州市銅山區(qū)班井村大豆植株中分離,經(jīng)江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所大豆課題組篩選鑒定后保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2 培養(yǎng)基

多粘類芽孢桿菌XZ-2菌株發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基使用LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L、蒸餾水1000 mL, pH 7.0),在121 ℃高壓蒸汽下滅菌20 min。菌株活化采用LBA固體培養(yǎng)基(上述LB液體培養(yǎng)基+瓊脂粉15 g/L)。

1.3 菌體生物量的測(cè)定

采用酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan GO, USA),取300 μL發(fā)酵液于酶標(biāo)板中,以LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照,測(cè)定OD600值,以O(shè)D600值作為判斷菌體生物量大小的標(biāo)準(zhǔn),OD600值大則菌量大[8]。

1.4 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

碳源:以LB液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用酵母提取物、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和可溶性淀粉作為碳源,制成含有10 g/L單一碳源的LB液體培養(yǎng)基(100 mL/250 mL)。將活化后的菌懸液以5%(體積分?jǐn)?shù))分別接種到不同碳源的液體培養(yǎng)基中,置于28 ℃、180 r/min轉(zhuǎn)速搖床中培養(yǎng)24 h后取出,在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD600值,每個(gè)處理3次重復(fù)。

氮源:采用賴氨酸、蛋白胨、磷酸二氫銨、氯化銨和L-天冬酰胺，分別制成含10 g/L單一氮源的LB液體培養(yǎng)基；其他接種、培養(yǎng)和測(cè)定方法同上,每個(gè)處理3次重復(fù)。

無(wú)機(jī)鹽:分別向LB液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加5 g/L的硫酸鋅、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈣、氯化鉀；其他接種、培養(yǎng)和測(cè)定方法同上,每個(gè)處理3次重復(fù)。

多因素正交實(shí)驗(yàn):以單因素實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳碳源蔗糖、最佳氮源蛋白胨以及無(wú)機(jī)鹽硫酸鎂和氯化鈣等4個(gè)變異因素,采用如表1所示的L9(34)正交表進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn),培養(yǎng)基pH值為7.0,在發(fā)酵溫度為28 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h,以O(shè)D600值分析4因素3水平對(duì)菌體生物量的影響,確定培養(yǎng)基的最佳配方,每個(gè)處理3次重復(fù)[9]。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素 g/L

1.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參考趙爽等的設(shè)計(jì)方法[10-12],在優(yōu)化得到的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,分別對(duì)培養(yǎng)基的初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量以及接種量進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH將培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)成4、5、6、7、8、9,每個(gè)處理裝液量為150 mL,然后接種5%的菌懸液,在轉(zhuǎn)速180 r/min、發(fā)酵溫度28 ℃條件下?lián)u培24 h后測(cè)定OD600值。將發(fā)酵溫度設(shè)置為20、25、30、35、40、45 ℃,接種量、轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時(shí)間等其他條件及測(cè)定方法同上。將發(fā)酵時(shí)間設(shè)置為12、24、36、48、60、72 h,其他培養(yǎng)條件不變。將轉(zhuǎn)速設(shè)置為90、120、150、180、210、240 r/min,其他培養(yǎng)條件不變。在250 mL三角瓶中分別裝培養(yǎng)基40、60、80、100、120、140 mL,其他培養(yǎng)條件不變。按體積分?jǐn)?shù)將接種量設(shè)置為1%、3%、5%、7%、9%、11%,其他培養(yǎng)條件不變,分別測(cè)定OD600值,每組試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和作圖,采用生物統(tǒng)計(jì)分析軟件DPS進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多粘類芽孢桿菌XZ-2的培養(yǎng)基優(yōu)化

分別以酵母提取物、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和可溶性淀粉作為碳源,研究它們對(duì)多粘類芽孢桿菌XZ-2生物量的影響。結(jié)果如圖1所示,在供試的5種碳源中,蔗糖作為碳源時(shí)XZ-2的生長(zhǎng)量最大,其發(fā)酵液OD600值達(dá)到0.805,與其他4種碳源培養(yǎng)基上得到的生物量呈極顯著差異;其次是葡萄糖和可溶性淀粉,其OD600值分別為0.626和0.586;以麥芽糖和酵母提取物作為碳源的培養(yǎng)基上得到的生物量較小,其OD600值分別為0.428和0.327。因此選取蔗糖作為最佳碳源。

圖中不同大寫字母表示1%極顯著水平差異。下同。

由于有機(jī)氮源成本較高,因此本研究以無(wú)機(jī)氮源為主,結(jié)果如圖2所示。菌株XZ-2在以蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源時(shí)生物量最大,其OD600值為0.677,與其他4種氮源條件下培養(yǎng)獲得的生物量呈極顯著差異;其次為磷酸二氫銨和氯化銨,其獲得的OD600值分別為0.423和0.286;而在以L-天冬酰胺和賴氨酸為氮源的培養(yǎng)基上獲得的生物量較小,其OD600值分別為0.139和0.053。因此選取蛋白胨作為培養(yǎng)基的最佳氮源。

圖2 不同氮源對(duì)多粘類芽孢桿菌XZ-2生長(zhǎng)的影響

分別以硫酸鎂、氯化鈣等5種無(wú)機(jī)鹽制備培養(yǎng)基,發(fā)酵結(jié)果如圖3所示。以硫酸鎂和氯化鈣為培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽時(shí)OD600值較高,分別為0.568和0.553,與其他3種無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的生物量呈極顯著差異；以硫酸鋅和硫酸錳為培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽時(shí),OD600值很小,菌株生長(zhǎng)非常緩慢。由于以硫酸鎂和氯化鈣作為無(wú)機(jī)鹽的條件下該菌株的生長(zhǎng)量沒(méi)有極顯著差異,因此下一步采用硫酸鎂和氯化鈣作為培養(yǎng)基的復(fù)合無(wú)機(jī)鹽。

圖3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)多粘類芽孢桿菌XZ-2生長(zhǎng)的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基成分優(yōu)化

從表2、表3中可以看出：不同水平的蔗糖和蛋白胨對(duì)XZ-2的生長(zhǎng)量有一定的影響,具體表現(xiàn)為蔗糖和蛋白胨的濃度越高,XZ-2的生長(zhǎng)量越高,極差分別為0.141和0.088;不同水平的硫酸鎂對(duì)XZ-2的生長(zhǎng)量也有一定的影響,XZ-2的生長(zhǎng)量隨著硫酸鎂濃度從3 g/L增加到5 g/L而不斷增加,但當(dāng)硫酸鎂濃度從5 g/L增加到7 g/L時(shí)XZ-2的生長(zhǎng)量反而下降,極差為0.073;不同水平的氯化鈣對(duì)XZ-2生長(zhǎng)量的影響表現(xiàn)為隨著濃度升高而下降,極差為0.051。結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定該菌株的最適發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:蔗糖15 g/L,蛋白胨15 g/L,硫酸鎂5 g/L和氯化鈣3 g/L。

表2 培養(yǎng)基組分正交實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

注：括號(hào)外為設(shè)計(jì)的水平值，括號(hào)內(nèi)為設(shè)計(jì)的實(shí)際濃度值(計(jì)量單位為g/L)。

表3 培養(yǎng)基組分正交實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果發(fā)酵液的OD600值)

注: K1、K2、K3分別代表蔗糖、蛋白胨、硫酸鎂和氯化鈣的3種水平與其他因素組合時(shí)XZ-2發(fā)酵液的OD600值。

2.3 XZ-2培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 初始pH值的優(yōu)化 由圖4a可見(jiàn),不同初始pH條件對(duì)多粘類芽孢桿菌XZ-2的發(fā)酵有一定的影響。具體來(lái)說(shuō)：當(dāng)pH值為4～8時(shí),XZ-2菌株的生長(zhǎng)量呈上升趨勢(shì)；當(dāng)pH值為8時(shí),XZ-2發(fā)酵液的OD600最大,達(dá)到0.727;但pH值在6～8條件下發(fā)酵液的OD600值差異較小;當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為9時(shí),該菌株的生長(zhǎng)量極低。因此,多粘類芽孢桿菌XZ-2發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳初始pH值為8。

2.3.2 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 圖4b表明溫度對(duì)多粘類芽孢桿菌XZ-2的生長(zhǎng)有較大的影響。當(dāng)溫度為20～30 ℃時(shí),隨著溫度的升高菌株XZ-2的生長(zhǎng)量快速升高；當(dāng)溫度為30 ℃時(shí),XZ-2發(fā)酵液的OD600值達(dá)到最大，為0.784;當(dāng)發(fā)酵溫度在30～45 ℃時(shí),隨著溫度升高菌株的生長(zhǎng)量逐漸降低,且在45 ℃條件下生長(zhǎng)量極低。因此,確定30 ℃為該菌株的最佳發(fā)酵溫度。

2.3.3 培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化 由圖4c可見(jiàn)：XZ-2菌株在培養(yǎng)時(shí)間為12～24 h時(shí),發(fā)酵液的OD600值顯著升高,搖培24 h時(shí)發(fā)酵液的OD600值高達(dá)0.715;繼續(xù)搖培后發(fā)現(xiàn)菌株的生長(zhǎng)量逐漸下降。由此,我們認(rèn)為該菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間為24 h,該結(jié)果與菌株XZ-2的生長(zhǎng)曲線結(jié)果一致。

2.3.4 裝液量的優(yōu)化 不同的裝液量對(duì)菌株XZ-2的發(fā)酵有一定的影響,結(jié)果如圖4d所示,在250 mL三角瓶中,XZ-2的生長(zhǎng)量隨著裝液量的增加而增加,當(dāng)裝液量達(dá)到80 mL時(shí),XZ-2發(fā)酵液的OD600值最高,為0.811;隨著裝液量繼續(xù)增加,XZ-2發(fā)酵液的OD600值逐漸下降,但下降趨勢(shì)較小。因此,選擇250 mL三角瓶裝液80 mL為菌株XZ-2的最佳裝液量。

2.3.5 接種量的優(yōu)化 接種量對(duì)菌株XZ-2發(fā)酵的影響如圖4e所示,當(dāng)接種量從1%增加到3%時(shí),XZ-2發(fā)酵液的OD600值快速升高,當(dāng)接種量在3%時(shí),XZ-2發(fā)酵液的OD600值最大,為0.818；隨著接種量繼續(xù)增加,XZ-2發(fā)酵液的OD600值逐漸下降。說(shuō)明高接種量和低接種量都不利于該菌株的生長(zhǎng),因此確定該菌株的最佳接種量為3%。

2.3.6 轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 從圖4f可以看出,搖床轉(zhuǎn)速對(duì)XZ-2的生長(zhǎng)影響較大。當(dāng)轉(zhuǎn)速在90～180 r/min之間時(shí),隨著轉(zhuǎn)速的升高,該菌株的生長(zhǎng)量逐漸升高;當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)OD600最大,為0.723;當(dāng)轉(zhuǎn)速繼續(xù)升高時(shí),菌株發(fā)酵液的OD600值則逐漸下降,因此認(rèn)為180 r/min為菌株XZ-2發(fā)酵培養(yǎng)的最佳轉(zhuǎn)速。

圖4 不同發(fā)酵條件對(duì)多粘類芽孢桿菌XZ-2生長(zhǎng)的影響

3 討論與結(jié)論

單因素試驗(yàn)是在假設(shè)不同因素間不存在相互作用的前提下,通過(guò)一次只改變一個(gè)因素而其他因素維持不變,研究不同因素對(duì)結(jié)果的影響,是試驗(yàn)中最常用的優(yōu)化策略之一[12]。然而,大部分培養(yǎng)基成分復(fù)雜,僅通過(guò)單因素試驗(yàn)往往無(wú)法獲得準(zhǔn)確的結(jié)果,特別是在試驗(yàn)因素較多的情況下,需要進(jìn)行較多的試驗(yàn)次數(shù)和試驗(yàn)周期才能完成各因素的逐個(gè)優(yōu)化篩選[13-14]。因此,單因素試驗(yàn)經(jīng)常被用在正交試驗(yàn)之前或與正交試驗(yàn)相結(jié)合使用。正交試驗(yàn)是利用一套表格,設(shè)計(jì)多因素、多指標(biāo)、多因素間存在交互作用而具有隨機(jī)誤差的試驗(yàn),并利用普通的統(tǒng)計(jì)分析方法來(lái)分析試驗(yàn)結(jié)果[15]。本文采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法,對(duì)XZ-2的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明XZ-2的最佳碳源為蔗糖,最佳氮源為蛋白胨,最佳無(wú)機(jī)鹽為硫酸鎂和氯化鈣;結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果開(kāi)展正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示該菌株的最佳培養(yǎng)基組分為蔗糖15 g/L,蛋白胨15 g/L,硫酸鎂5 g/L,氯化鈣3 g/L。同時(shí),通過(guò)研究?jī)?yōu)化了菌株XZ-2的發(fā)酵條件:培養(yǎng)基初始pH值8,發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵時(shí)間24 h,裝液量80 mL/250 mL,接種量3%,轉(zhuǎn)速180 r/min。

近年來(lái),關(guān)于多粘類芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化的相關(guān)報(bào)道有很多,如陳小煌等研究發(fā)現(xiàn)：多粘類芽孢桿菌菌株B-306的最適培養(yǎng)基為:碳源可溶性淀粉17.5 g/L、氮源蛋白胨25.0 g/L、無(wú)機(jī)鹽NaCl 1.25 g/L、Na2HPO40.5 g/L、CaCl21.0 g/L;最適發(fā)酵條件為:初始pH值7.5,培養(yǎng)溫度30 ℃,轉(zhuǎn)速170 r/min,裝液量80 mL/250 mL,接種量10%[7]。金莉萍等對(duì)多粘類芽孢桿菌CF05的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果篩選出碳源豆粕10 g/L和魚粉10 g/L,氮源玉米粉20 g/L,無(wú)機(jī)鹽MgSO40.5 g/L和CaCl20.5 g/L為最適培養(yǎng)基配方,且初始pH值7.2、培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量2%為該菌株的最適發(fā)酵條件[16]。林茂茲等研究表明多粘類芽孢桿菌S960的最佳發(fā)酵條件是:初始pH值7.0,轉(zhuǎn)速150 r/min,裝液量25 mL/250 mL,接種量2%[17]。王智文等對(duì)Cp-S316菌株抗真菌活性物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)最佳培養(yǎng)基配方為土豆100 g、乳糖40 g、蛋白胨15 g、硝酸鈉0.5 g、硫酸鎂2 g、水1 L,最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基初始pH值6.3～6.5,培養(yǎng)溫度30 ℃,接種量2%,裝液量100 mL/500 mL[18]。對(duì)比以上研究結(jié)果和本文研究結(jié)論,我們發(fā)現(xiàn)不同多粘類芽孢桿菌菌株的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件之間存在差異,這可能與菌株的地理來(lái)源和采集環(huán)境相關(guān)。對(duì)此,我們應(yīng)根據(jù)菌株差異選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件,使該菌株的生長(zhǎng)和防治效果得到最佳發(fā)揮。以后,我們還將進(jìn)一步研究培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件對(duì)XZ-2發(fā)酵液抑菌活性的影響,為該菌株的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。