用正交試驗法優(yōu)化香水百合試管鱗莖的誘導(dǎo)

祁宏英,徐洪國,楊偉麗

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點實驗室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

香水百合(Liliumoriental hybrid ‘Casa Blanca’)為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生鱗莖類球根花卉,是重要的切花和盆花植物[1]。香水百合花色艷麗,芳香宜人,被譽(yù)為百合中的“女王”,是盆栽和點綴花園、庭院的名貴花卉,也是世界各地廣泛應(yīng)用的切花材料[2-3]。香水百合通常采用分鱗莖、分珠芽、扦插的無性繁殖方法進(jìn)行繁殖,但是采用傳統(tǒng)繁殖方法極易感病,導(dǎo)致鱗莖逐年變小退化,繁殖系數(shù)也比較低,所以在短期內(nèi)難以滿足市場需求,目前國內(nèi)百合切花生產(chǎn)所用的優(yōu)質(zhì)種球仍依賴從國外進(jìn)口[1,4]。百合組培苗具有繁殖系數(shù)高、繁殖周期短等優(yōu)點,剛好彌補(bǔ)了種球繁育的不足,而且容易保持原品種的優(yōu)良觀賞特性,對保護(hù)百合品種資源具有重要的理論意義和實踐意義。百合的再生能力強(qiáng),鱗片、葉片、花絲、花藥、花瓣、珠芽、種子、胚等離體培養(yǎng)前人均有報道。崔祺等[5]報道淡黃花百合種子萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基為MS+0.01 mg/L NAA+60 g/L蔗糖,適于‘索邦’、‘雷山3號’鱗片誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基分別為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA和MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA;劉雅莉等[6]以花梗、花托、花瓣和花絲為外植體均可直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽,誘導(dǎo)不定芽的適宜培養(yǎng)基為N6+BA 1.0 mg/L +KT 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L;農(nóng)艷豐等[7](2014)對OT型百合的花蕾和半開花的不同部位進(jìn)行了愈傷組織誘導(dǎo),誘導(dǎo)從易到難表現(xiàn)為子房>柱頭>花藥>花托>花絲、花瓣,其中子房和柱頭的愈傷組織誘導(dǎo)率均超過50.0%。王雅楠等[8]認(rèn)為新疆百合鱗片最適的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA;不同部位鱗片的誘導(dǎo)率為內(nèi)層>中層>外層、中部>下部>上部；最適增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA,增殖系數(shù)達(dá)3.46;最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L,生根率達(dá)100%。謝松林等[9]對百合雜種幼胚進(jìn)行了離體培養(yǎng),胚、胚乳及胚珠3種外植體的離體培養(yǎng)萌發(fā)率分別為100.0%、21.5%和1.0%,認(rèn)為胚、胚乳及胚珠培養(yǎng)是從幼胚獲得百合雜種植株的高效途徑。牛俊樂等[10]利用無菌葉片、花器官培養(yǎng)獲得的無菌小鱗片及葉片為材料建立了無性快繁體系。

正交試驗方法是利用正交表進(jìn)行科學(xué)的安排與分析多因素試驗的方法。其主要優(yōu)點是能在很多試驗方案中挑選出代表性強(qiáng)的少數(shù)幾個試驗方案,并且通過對這少數(shù)試驗方案實驗結(jié)果的分析,推斷出最優(yōu)方案。目前關(guān)于百合快繁的研究雖然很多,但多數(shù)都是單獨(dú)研究外植體的,或者培養(yǎng)基的篩選,將外植體和激素濃度組合在一起進(jìn)行探討的相對較少。影響百合鱗莖試管苗誘導(dǎo)的因素有很多,培養(yǎng)條件的篩選工作量較大。為了降低實驗次數(shù),節(jié)約實驗成本,我們以香水百合的鱗片為外植體,采用正交設(shè)計L9(34)對香水百合小鱗莖的誘導(dǎo)因子進(jìn)行了研究,以期建立百合小鱗莖大量繁殖的技術(shù)流程,為國內(nèi)百合商品種球的大量生產(chǎn)提供理論依據(jù),為百合的遺傳轉(zhuǎn)化和基因工程育種提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

香水百合(Liliumoriental hybrid ‘Casa Blanca’ )。

1.2 外植體的選取及消毒

選取無病蟲害、外觀整齊干凈、光滑的香水百合的鱗莖,用流水沖洗60 min左右,直到把鱗莖表面的泥土污垢沖干凈為止。在無菌操作臺上先把鱗莖分成外層、中層和內(nèi)層，放于標(biāo)記好的錐形瓶中,用75%的酒精浸泡1 min,然后用0.1%的升汞浸泡10 min,期間不斷搖晃錐形瓶,使其消毒充分均勻；最后用無菌水沖洗3～4次。

1.3 試驗設(shè)計

采用L9(34)正交試驗設(shè)計(表1、表2),在接種操作中把分撥下來的鱗片按形態(tài)學(xué)上、中、下3部分切成0.5 cm× 0.5 cm的小塊,分別接種到添加了不同濃度激素組合的MS(蔗糖含量為3%,瓊脂含量為0.7%)初代培養(yǎng)基上,且在整個培養(yǎng)的過程中香水百合的鱗片都是以內(nèi)側(cè)的一面向上接種到培養(yǎng)基中[11],每瓶接種5塊,每個處理接種6瓶,3次重復(fù)。每周觀察外植體的變化,培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計鱗片分化試管鱗莖數(shù),計算分化數(shù)和分化率。

表1 試管鱗莖誘導(dǎo)正交試驗因素及其水平

表2 試管鱗莖誘導(dǎo)正交試驗設(shè)計

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香水百合試管鱗莖誘導(dǎo)正交試驗結(jié)果

正交試驗各處理均重復(fù)3次,取其平均值,并將各項數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。根據(jù)試驗結(jié)果求出每個因素每一水平下的分化數(shù)平均值Ki,并求出同一因素不同水平間平均值的極差R。從表3中的R值可以看出，各因素對誘導(dǎo)試管鱗莖的影響從大到小依次為NAA>6-BA>鱗片層次>鱗片部位。Ki值反映了不同因素各水平對試管鱗莖誘導(dǎo)的影響情況,Ki值越大,誘導(dǎo)效果越好。根據(jù)表3中4個因素各水平下的Ki值，可知香水百合試管鱗莖誘導(dǎo)的最優(yōu)條件組合為A2B3C2D2,即基本培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+中層鱗片+鱗片中部部位的組合。該最佳組合并沒有在正交表中出現(xiàn),但與6號處理接近,僅鱗片層次不同,平均再生芽數(shù)達(dá)到了4.56。

2.2 正交試驗結(jié)果的方差分析

用SPSS軟件對正交試驗中香水百合鱗片分化試管鱗莖的平均數(shù)進(jìn)行方差分析。表4中的F值表明：除鱗片部位外,其余的因素(NAA濃度、6-BA濃度、鱗片層次)各水平對試管鱗莖平均分化數(shù)的影響均達(dá)到了極顯著水平(P<0.01),可進(jìn)一步進(jìn)行因素內(nèi)多重比較分析；其中NAA濃度對試驗結(jié)果的影響最大。多重比較分析結(jié)果表明：0.1 mg/L NAA的誘導(dǎo)效果最佳，顯著優(yōu)于其他2個濃度水平下的；6-BA濃度對試驗結(jié)果的影響僅次于NAA,其最佳濃度為2.0 mg/L；鱗片部位對分化數(shù)結(jié)果的影響并不顯著,無統(tǒng)計意義,因此3個部位的鱗片都可以作為香水百合的外植體。

表3 香水百合試管鱗莖誘導(dǎo)正交試驗結(jié)果及分析

注:Ki為各因素在各個水平下的分化數(shù)平均值;R為極差。

表4 香水百合試管鱗莖誘導(dǎo)正交試驗的方差分析結(jié)果

注:“**”代表達(dá)到0.01顯著水平。

2.3 香水百合試管鱗莖最佳誘導(dǎo)條件的驗證

利用正交試驗法得到香水百合試管鱗莖誘導(dǎo)的最佳條件為基本培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA +2.0 mg/L 6-BA+中層鱗片+鱗片中部部位的組合。在此條件下進(jìn)行誘導(dǎo)香水百合試管鱗莖的驗證試驗,結(jié)果誘導(dǎo)率達(dá)到100%,平均分化數(shù)達(dá)到4.89。

3 討論

誘導(dǎo)鱗片外植體形成試管鱗莖時,內(nèi)層鱗片的分化效果較好,這與大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果[8-9]一致。鱗片部位在本試驗中對小鱗莖分化數(shù)結(jié)果的影響并不顯著,這與趙靜等[13]的研究結(jié)果有所不同,可能與材料特性有關(guān)。在試管鱗莖的誘導(dǎo)中一般使用細(xì)胞分裂素與生長素的配比,但過高濃度的生長素容易使試管鱗莖的誘導(dǎo)力降低,產(chǎn)生大量愈傷組織或不定根；一般認(rèn)為MS培養(yǎng)基較適于百合的離體培養(yǎng),添加外源激素以6-BA和NAA配比為佳。本試驗結(jié)果表明,香水百合組織培養(yǎng)的最佳分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，在此條件下可得到很高的分化率和分化數(shù)。

正交試驗法是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的實驗設(shè)計方法[14]。該方法在植物組織培養(yǎng)中有著重要的應(yīng)用價值,在百合組織培養(yǎng)中也有所應(yīng)用[2,15-16]。但多數(shù)學(xué)者僅依據(jù)極差值對正交試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,而未進(jìn)行方差分析。方差分析法不僅是對正交試驗結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確分析的保證，而且也是檢驗該試驗結(jié)果是否可靠的重要方法[17]。本文通過正交試驗一次性對香水百合試管鱗莖誘導(dǎo)過程中最主要的4個因素(NAA、6-BA、鱗片層次和鱗片部位)進(jìn)行了有重復(fù)的極差分析和方差分析研究,探究了不同因素的影響大小，并篩選出香水百合試管鱗莖誘導(dǎo)的最佳組合條件,這為下一步開展香水百合再生體系的構(gòu)建和進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化奠定了理論基礎(chǔ)。