基于SSR標(biāo)記的桃種質(zhì)資源遺傳多樣性研究

凌士鵬，孫 萍，林賢銳，沈建生

(浙江省金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 金華 321000)

桃是薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)植物，起源地是中國(guó)的西部地區(qū)，分布點(diǎn)主要是歐、亞、美、澳、非等五大洲，其種植范圍特別廣、適應(yīng)性比較強(qiáng)、種質(zhì)資源極為豐富[1]。桃經(jīng)過(guò)多年的自然選擇和人工馴化種植，形成了許多的類(lèi)型和品系，這些資源為進(jìn)一步改良桃的相關(guān)性狀提供了基礎(chǔ)，了解這些資源是利用的前提[2]。目前，相關(guān)研究表明：我國(guó)擁有北京、南京、鄭州3個(gè)國(guó)家級(jí)桃種質(zhì)資源圃以及很多地方桃種質(zhì)資源圃，收集并保存了6個(gè)種，共2000多份種質(zhì)資源[3]，桃作為世界上栽培最為廣泛的落葉果樹(shù)之一，現(xiàn)已遍布全球，居核果類(lèi)果樹(shù)之首[4]。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)很多學(xué)者對(duì)桃亞屬種間分類(lèi)進(jìn)行了研究，目前已經(jīng)在形態(tài)學(xué)[1]、酶學(xué)[5]、孢粉學(xué)[6]、細(xì)胞學(xué)[7]、分子標(biāo)記[8-11]等方面獲得了一些桃資源分類(lèi)及親緣關(guān)系等的結(jié)論和觀點(diǎn)。但是研究發(fā)現(xiàn)，從形態(tài)學(xué)方面對(duì)品種進(jìn)行分類(lèi)需要看經(jīng)驗(yàn)，因此對(duì)于一些種間的雜種進(jìn)行歸類(lèi)十分困難，更無(wú)法判斷其起源；另外，利用同工酶、染色體核型等試驗(yàn)手段也同樣面臨著更多的問(wèn)題。因此開(kāi)展桃分子標(biāo)記輔助分類(lèi)具有重要意義。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeat，SSR)標(biāo)記的特點(diǎn)是等位基因變異數(shù)多、信息含量及多態(tài)性高，穩(wěn)定性、重復(fù)性好，屬共顯性遺傳，特異性強(qiáng)，并且在種屬間有良好的通用性[14]，是目前果樹(shù)上鑒定種質(zhì)資源、分析遺傳多樣性及親緣關(guān)系應(yīng)用中最為廣泛的分子標(biāo)記。同時(shí)，Verde等[12]基于桃不同器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)研究后上傳至NCBI共80797條ESTs序列，為挑選更好的桃SSR引物提供了豐富的資源。筆者所在課題組已于前期對(duì)部分桃種質(zhì)資源進(jìn)行了調(diào)查、收集保存，因此在此基礎(chǔ)上，本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)收集保存的桃種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性的評(píng)價(jià)，以期為后續(xù)桃種質(zhì)資源的綜合利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 植物材料

于各地收集桃地方品種(品系)共53份，嫁接于浙江省金華國(guó)家高科技農(nóng)業(yè)園區(qū)的桃李品種園，詳細(xì)內(nèi)容見(jiàn)表1。試驗(yàn)材料為健康幼嫩葉片，采集并分別置于采集袋內(nèi)，同時(shí)利用變色硅膠迅速干燥，帶回實(shí)驗(yàn)室，挑取干燥的葉片進(jìn)行DNA提取。

表1 供試的桃品種(品系)

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采用CTAB法[13]從采集的葉片中提取總DNA，用雙蒸水稀釋到10～30 ng/μL，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 SSR標(biāo)記 隨機(jī)抽取8個(gè)桃樣品的DNA模板，選用56對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物利用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳約2.5 h，后銀染顯色。從中篩選出12對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定的引物進(jìn)行SSR擴(kuò)增，詳見(jiàn)表2。試驗(yàn)前對(duì)篩選好的12對(duì)引物進(jìn)行熒光修飾，即在單向引物的5′端或3′端加上熒光修飾基團(tuán)，便可實(shí)現(xiàn)微衛(wèi)星多態(tài)性的熒光半自動(dòng)檢測(cè)。熒光引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系及SSR擴(kuò)增程序詳見(jiàn)孫萍等[17]2017年發(fā)表的文章。擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)PCR產(chǎn)物用滅菌的雙蒸水稀釋100～200倍，利用ABI 3130測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)；數(shù)據(jù)采集采用Gene Mapper 4.0儀器在電泳結(jié)果60～350 bp片段大小范圍內(nèi)進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序的結(jié)果導(dǎo)入Genetic Profile v1.0軟件中，參照峰值的強(qiáng)度及分子內(nèi)標(biāo)大小，確定微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增片段的區(qū)間，對(duì)片段大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如果出現(xiàn)多峰型的樣品，則需重新進(jìn)行PCR試驗(yàn)后重新檢測(cè)，以Excel格式保存統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以備后續(xù)分析[17]。

利用遺傳數(shù)據(jù)分析軟件GenAlEx 6.3[18]計(jì)算多態(tài)性等位基因數(shù)(Na)、SSR位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)等遺傳多樣性指標(biāo)。

用Population 1.2[19]軟件對(duì)53個(gè)桃種質(zhì)資源進(jìn)行Neighbor-Joining聚類(lèi)分析，并描繪和修改聚類(lèi)圖[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

從表3可以看出，12對(duì)SSR引物在所有桃樣品中的多態(tài)性等位基因數(shù)(Na)從6到11不等，等位基因數(shù)平均值為7.917。有效等位基因數(shù)(Ne)從1.773(CPPCT042)到4.657(BPPCT026)，平均值為3.399。其中，引物CPPCT022擴(kuò)增出的等位基因數(shù)為11個(gè)，可以區(qū)分53個(gè)品種中的22個(gè)品種；多態(tài)性較好的引物為CPPCT022、BPPCT038、CPPCT026、BPPCT025、UDP96-005，能區(qū)分幾乎所有53個(gè)桃地方品種。

在本研究中，觀察雜合度(Ho)為0.436(CPPCT042)～0.922(BPPCT038)，平均值為0.657。期望雜合度(He)為0.436(CPPCT042)～0.785(BPPCT026)，平均期望雜合度為0.678。Shannon多樣性指數(shù)(I)為0.939(CPPCT042)～1.698(BPPCT038)，平均值為1.409。反映了所收集保存的桃種質(zhì)資源的遺傳變異程度較高，遺傳多樣性較高。

表2 SSR引物及擴(kuò)增的長(zhǎng)度范圍

表3 53個(gè)栽培桃品種12對(duì)引物的遺傳參數(shù)

2.2 聚類(lèi)分析

通過(guò)SSR數(shù)據(jù)對(duì)53個(gè)地方桃品種進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建親緣關(guān)系圖(圖1)。從聚類(lèi)分析圖可以得出：53個(gè)地方桃品種分成了3組，第一組中包括大觀、江山早、加納桃、紅清水等11個(gè)品種，其中大觀和江山早的相似系數(shù)為0.96，晚熟1號(hào)桃和2號(hào)桃的相似系數(shù)為0.98，說(shuō)明它們之間遺傳關(guān)系很近；第二組包括了35個(gè)品種，其中518油桃和千年紅的相似系數(shù)為1.00，即為同物異名的現(xiàn)象；第三組包括了其余的9個(gè)品種，其中新玉和東溪小仙桃的相似系數(shù)為0.94，也表現(xiàn)出了很近的親緣關(guān)系。

圖1 基于Nei的遺傳距離的Neighbor-Joining聚類(lèi)分析圖

3 小結(jié)與討論

3.1 遺傳多樣性分析

雜合度的高低及等位基因數(shù)的多少是反映所選用SSR位點(diǎn)鑒別植物基因型能力的重要指標(biāo)[17]。本研究結(jié)果表明：所選用的12個(gè)SSR引物其多態(tài)性較高，可以用于地方桃品種的鑒定和遺傳多樣性分析，另外也表明了筆者前期所收集保存的地方桃種質(zhì)資源遺傳變異較為豐富。

12對(duì)引物在所有樣品中等位基因的平均值為7.917，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為3.399，平均觀察雜合度(Ho)為0.657，期望雜合度(He)的平均值為0.678，與史紅麗等[21]的研究結(jié)果相似(Ne=3.4)，比Ghaffari等[22]在扁桃上的研究結(jié)果稍低(Na=8.8，Ho=0.7，He=0.79)、但顯著高于Aranzana等[23]在桃上的研究結(jié)果(Na=6.6～7.3，Ho=0.35，He=0.50～0.55)。另外，本研究中桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平與杏[24](Na=3.5，Ho=0.58)、櫻桃[25](Na=3.5～6.0，He=0.49～0.66)等其他李屬植物的研究結(jié)果相比，有明顯差異，表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平。這為桃種質(zhì)資源圃的建立奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.2 遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于Nei距離的Neighbor-Joining聚類(lèi)分析清楚檢測(cè)到桃供試樣品的遺傳結(jié)構(gòu)：53個(gè)地方桃品種分成了3組，其中第一組中的大觀和江山早均為早熟桃品種，形態(tài)學(xué)性狀相近；晚熟1號(hào)桃和2號(hào)桃均為晚熟桃品種，形態(tài)學(xué)性狀也極其相近；另外，第一組中的加納、紅清水、上汗這3個(gè)桃品種均為日本選育的品種。第二組的518油桃和千年紅的相似系數(shù)為1.00，為同物異名的現(xiàn)象；春瑞、春雪、春蜜、突圍這4個(gè)桃均為早熟桃品種，形態(tài)學(xué)特征相似；紅蕓果、艷光、中油5號(hào)、超麗春、千年紅、京東巨油、超早油桃這幾個(gè)品種均為油桃品種，聚在一起；紅冠、夏香姬、沙紅、雪雨露這4個(gè)品種形態(tài)學(xué)特征相似，聚在一起。第三組中新玉和東溪小仙桃的相似系數(shù)為0.94，也表現(xiàn)出了很近的遺傳關(guān)系。

在不同的桃類(lèi)群中，大部分遺傳關(guān)系較近的品種以及部分形態(tài)學(xué)性狀相近的品種聚在一起，說(shuō)明其聚類(lèi)分析結(jié)果與桃系譜以及生物學(xué)特征具有一定的關(guān)聯(lián)性，但也不是完全一致的。部分形態(tài)學(xué)性狀相差較大的桃品種，如錦繡和紅燕露、天鮮紅在聚類(lèi)圖中聚集在一起，說(shuō)明這3個(gè)桃品種之間的基因型存在相互滲透的現(xiàn)象，親緣關(guān)系較近。造成這種現(xiàn)象的原因可能是控制桃肉色性狀的基因發(fā)生了幾個(gè)堿基的變化，而通過(guò)SSR分析檢測(cè)不到堿基的微小變異，也可能與桃本身遺傳結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜有關(guān)。

本研究結(jié)果也顯示出聚類(lèi)結(jié)果與桃品種的地理分布之間存在一定相關(guān)性，如日本桃品種、部分地方品種分別較為集中的聚在一起。但也有部分來(lái)自不同地區(qū)甚至地理距離較遠(yuǎn)的桃品種，其遺傳距離表現(xiàn)非常相近，造成這種現(xiàn)象的原因可能與品種所處的環(huán)境條件相似，或者人工干預(yù)較為相近有一定的關(guān)系。因此在選擇雜交親本時(shí)，應(yīng)注重?cái)U(kuò)大地域選擇范圍，這對(duì)于提高遺傳多樣性具有明顯意義。

另外，研究還存在著普通桃和油桃聚為一類(lèi)的交叉現(xiàn)象，說(shuō)明各桃品種之間通過(guò)多年的自然選擇，以及雜交育種過(guò)程中基因之間相互滲透，從而形成了較為豐富的遺傳多樣性，同時(shí)通過(guò)生態(tài)條件的變化以及人工干預(yù)，形成了不同的品種(品系)類(lèi)型。

本研究采用SSR標(biāo)記來(lái)研究桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性，結(jié)果表明：SSR標(biāo)記是一種經(jīng)濟(jì)、可靠的分子標(biāo)記技術(shù)。從本研究的結(jié)論可以看出，所收集到的桃種質(zhì)資源遺傳變異較為豐富，遺傳多樣性水平較高，對(duì)今后桃種質(zhì)資源的保存和利用具有一定的參考價(jià)值。但本研究發(fā)現(xiàn)部分性狀差別較大的地方桃品種在聚類(lèi)圖上聚為一類(lèi)，這有待于進(jìn)一步研究和論證。