美托洛爾對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌損傷及c-fos信號(hào)通路的影響

徐燕

（北京王府中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 心內(nèi)科，北京 100049）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是冠狀動(dòng)脈突發(fā)持續(xù)缺血缺氧而造成的心肌壞死急癥，嚴(yán)重影響患者身心健康[1]。有關(guān)研究認(rèn)為[2]，原癌基因c-fos與心血管疾病密切相關(guān)，c-fos是細(xì)胞響應(yīng)外界刺激最先表達(dá)的基因，其編碼蛋白c-fos不能直接發(fā)揮作用，只有與c-Jun蛋白結(jié)合成激活蛋白轉(zhuǎn)錄因子1（activator protein transcription factor-1, AP-1），才能激活靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。突發(fā)心肌缺血時(shí)，c-fos能即刻快速表達(dá)，它在將刺激轉(zhuǎn)換為胞內(nèi)信號(hào)過程中發(fā)揮很重要的作用[3]。MAPK家族成員ERK1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2）是將胞外刺激信號(hào)傳遞到胞內(nèi)的共同通路，ERK1/2自我磷酸化后可通過磷酸化Elk-1（Ets-like protein-1），進(jìn)而誘導(dǎo)c-fos的轉(zhuǎn)錄[4]。美托洛爾是臨床常用選擇性β1-受體阻滯藥，其能降低心臟做功從而減少心肌需氧，在治療AMI時(shí)，它能有效緩解胸痛，縮小梗死面積，延緩心力衰竭進(jìn)程，但目前關(guān)于美托洛爾治療AMI的具體作用機(jī)制尚不完全明確[5-6]。本研究通過復(fù)制AMI大鼠模型，在AMI大鼠服用美托洛爾后檢測(cè)ERK1、ERK2、c-fos的表達(dá)情況，探究美托洛爾減輕AMI大鼠心肌損傷的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠150只，平均體重（328±20）g，購自北京維通利華公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 酒石酸美托洛爾（英國(guó)阿斯利康制藥公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H32025390）。肝素鈉注射液（南京新百藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H32025851）。RNA提取試劑盒（美國(guó) Invitrogen公司）。buffer、dNTPs、RNase抑制劑、M-MLV[寶生物工程（大連）有限公司]。蛋白提取試劑（南京凱基生物公司）。c-Fos、ERK1/2、p-ERK1/2兔抗大鼠IgG溶液（一抗溶液）（美國(guó)Sigma公司）。堿磷酶標(biāo)記山羊抗兔IgG溶液（二抗溶液）（美國(guó)Sigma公司）。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）儀（美國(guó)Beckman Couhe公司），GIS-2020數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.2 動(dòng)物模型復(fù)制

本研究參考尹倪等[7]方法復(fù)制AMI模型。從150只大鼠中隨機(jī)取128只復(fù)制AMI模型，用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)后氣管插管，連接SAR-830小動(dòng)物呼吸機(jī)（美國(guó)CWE公司）輔助呼吸。于胸部4、5肋間開胸，在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳間下方1～2 mm處迅速結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，縫合傷口，撤走呼吸機(jī)。12導(dǎo)聯(lián)同步記錄心電圖儀監(jiān)測(cè)大鼠心電圖示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL、aVF導(dǎo)聯(lián)ST段抬高≤0.5 mV，確定復(fù)制模型成功。為防止感染，術(shù)后3 d內(nèi)腹腔注射青霉素。剩余22只行假手術(shù)，僅在左冠狀動(dòng)脈前降支穿線而不結(jié)扎，其他操作同上。

1.3 分組與給藥處理

128只大鼠中成功復(fù)制90只，死亡38只，將符合AMI模型的90只AMI大鼠隨機(jī)分為模型組、肝素組及美托洛爾組，每組各30只。另外22只行假手術(shù)的大鼠為假手術(shù)組。美托洛爾組在術(shù)后24 h直接灌胃給予0.1%美托洛爾生理鹽水10 mg/（kg·d），肝素組皮下注射給予肝素1 250 u/kg，模型組和假手術(shù)組直接灌胃給予等量生理鹽水，所有組均為10 ml/kg，1次/d。

1.4 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

術(shù)后48 h和4周，將大鼠用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉，仰臥固定，采用高分辨率超聲儀檢測(cè)大鼠心率（heart rate, HR）、射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction, EF）、短軸縮短率（fractional shortening, FS）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension, LVIDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimension, LVIDs）各值，測(cè)量3次，求取平均值。

1.5 心臟標(biāo)本的處理

術(shù)后4周超聲檢測(cè)結(jié)束后處死大鼠，剖胸取出心臟，用于制作心臟標(biāo)本。每組大鼠的心臟標(biāo)本隨機(jī)分為兩部分：液氮凍存與灌注4%多聚甲醛固定，將心臟標(biāo)本沿左室長(zhǎng)軸垂直方向切成3份，取中間部分制作成Masson病理切片，然后用顯微鏡圖像處理系統(tǒng)掃描切片，依次量取左室截面外周長(zhǎng)、瘢痕弧長(zhǎng)與內(nèi)周長(zhǎng)，心肌梗死面積（%）=2×瘢痕弧長(zhǎng)/（外周長(zhǎng)+內(nèi)周長(zhǎng)）×100%。

1.6 TUNEL法檢測(cè)心肌凋亡細(xì)胞

每組剖胸取出心臟后，用PBS洗凈血液，浸沒于4%多聚甲醛中，過夜，用30%蔗糖使心臟脫水下沉，接著在冷凍下進(jìn)行切片，TUNEL染色后，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)

以GAPDH作為內(nèi)參基因，用NCBI Primer Blast設(shè)計(jì)定量引物序列（由上海生工生物工程股份有限公司合成），引物序列見表1。

表1 引物序列

每組4只液氮冷凍保存的心臟組織，利用Trizol法提取RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度及濃度。取1.0μg總RNA，加入 Oligo（dT）1.0μl，加入13μl RNase-free H2O，混勻后，于85℃金屬浴中保溫5 min使RNA變性，然后放在冰上1 min以防RNA復(fù)性；然后繼續(xù)加入 4.0μl 5×buffer、2.0μl 10 mmol/L dNTPs、0.5μl RNase抑制劑、0.5μl M-MLV，混勻后30℃保溫10 min，42℃保溫1 h，85℃保溫10 min。合成cDNA第一鏈后，取5μl cDNA（稀釋20倍）為模板，加入10μl 2×SYBR Green qPCR Super Mix、0.5μlGAPDH（c-fos、ERK1或ERK2）正反向引物、4.0～20μl ddH2O，在qRT-PCR儀上擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 35 s,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。采用 2-ΔΔCt法分析 qRT-PCR 結(jié)果，ΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）±s；ΔΔCt=（ΔCt目的基因-ΔCt內(nèi)參基因）±s。

1.8 Western blot檢測(cè)

每組取4只大鼠心臟組織，充分研磨后使用組織蛋白提取試劑提取蛋白質(zhì)。每組樣品取50μl，用Lowry法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)節(jié)好蛋白濃度；將胞漿蛋白通過SDS-PAGE分離上清液，把分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上；將膜在1×TBS中浸泡10 min后，在5%牛血清蛋白溶液中封閉1 h，用1×TTBS洗滌2次，接著將膜分別置于在1︰100的c-Fos、ERK1/2、p-ERK1/2兔抗大鼠IgG溶液（一抗溶液）中，4℃孵育過夜；次晨將膜依次用1×TBS、1×TTBS快速清洗后，轉(zhuǎn)移到1︰1 000堿磷酶標(biāo)記山羊抗兔IgG溶液（二抗溶液）中在室溫下孵育2 h，依次用1×TTBS、1×TBS清洗后，用新配制的顯色液進(jìn)行顯色，待出現(xiàn)清晰的條帶后終止，最后使用GIS-2020數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)掃描并分析蛋白雜交條帶。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后，兩組間均數(shù)比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型成功復(fù)制

從150只大鼠中隨機(jī)取128只復(fù)制AMI模型，成功復(fù)制90只，死亡38只，且多在復(fù)制后24 h內(nèi)死亡；其余22只大鼠行假手術(shù)，死亡2只。將復(fù)制成功的90只大鼠隨機(jī)分為模型組、肝素組和美托洛爾組，每組各30只。AMI大鼠行肉眼觀察及心電圖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支后，結(jié)扎處下方心肌顏色即刻變淺，局部心肌活動(dòng)變緩，心電圖各肢體導(dǎo)聯(lián)ST段抬高≤0.5 mV，為復(fù)制模型成功的表現(xiàn)。

2.2 美托洛爾對(duì)AMI大鼠左心室功能的影響

AMI術(shù)后48 h和4周，與假手術(shù)組、模型組比較，肝素組和美托洛爾組大鼠心率下降（P＜0.05）。術(shù)后48 h，與假手術(shù)組比較，模型組、肝素組和美托洛爾組大鼠心臟EF、FS值均下降（P＜0.05）。術(shù)后4周，與模型組比較，肝素組和美托洛爾組大鼠心臟EF、FS值均提高（P＜0.05）。術(shù)后48 h，與假手術(shù)組比較，模型組、肝素組和美托洛爾組大鼠心臟LVIDd、LVIDs均增大（P＜0.05）。術(shù)后4周，與模型組比較，肝素組和美托洛爾組大鼠心臟LVIDd、LVIDs均降低（P＜0.05）。美托洛爾組超聲心動(dòng)圖各指標(biāo)與肝素組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。假手術(shù)組未出現(xiàn)心肌梗死，與模型組比較，肝素組和美托洛爾組大鼠心肌梗死面積減?。≒＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果（±s）

表2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果（±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 HR/（次/min） EF/% FS/% LVIDd/mm LVIDs/mm 心肌梗死面積/%AMI術(shù)后48 h假手術(shù)組（n =20） 476.5±20.1 97.1±1.3 63.4±5.3 6.3±0.9 2.0±0.5 0模型組（n =30） 485.2±17.0 65.5±6.91） 31.2±3.11） 7.2±0.71） 4.8±0.71） 58.3±3.11）肝素組（n =30） 413.7±23.91）2） 65.1±8.21） 31.7±4.81） 7.4±1.11） 4.7±0.71） 57.5±4.61）美托洛爾組（n =30） 418.6±25.71）2） 64.9±7.31） 32.1±4.61） 7.3±0.91） 4.7±0.61） 57.1±4.31）F值 80.884 120.165 278.227 6.797 99.214 1 344.926 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 AMI術(shù)后4周假手術(shù)組（n =20） 491.3±36.5 97.9±1.2 61.8±7.3 6.4±0.8 2.0±0.6 0模型組（n =30） 481.5±25.3 66.1±4.31） 33.1±5.01） 7.1±0.91） 4.7±0.51） 47.1± 5.21）肝素組（n =30） 372.4± 35.61）2） 87.3±6.41）2） 54.2±4.51）2） 6.4±0.92） 3.6±0.81）2） 42.3±4.01）美托洛爾組（n =30） 363.9± 38.11）2） 85.9±6.01）2） 52.4±4.11）2） 6.5±1.12） 3.5±0.61）2） 41.2±4.11）F值 108.626 174.619 150.853 3.661 71.965 643.338 P值 0.000 0.000 0.000 0.015 0.000 0.000

2.3 美托洛爾對(duì)AMI大鼠心肌損傷的影響

用顯微鏡觀察Masson染色結(jié)果，紅色代表正常心肌細(xì)胞，藍(lán)色代表膠原纖維。術(shù)后4周，假手術(shù)組心肌細(xì)胞分布整齊，膠原增生不多。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死邊緣的細(xì)胞雜亂分布，間質(zhì)中大量膠原增生，心肌纖維化水平升高。與模型組比較，肝素組和美托洛爾組藍(lán)色膠原減少，心肌纖維化水平降低。見圖1。

2.4 美托洛爾對(duì)AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL結(jié)果顯示，AMI術(shù)后4周，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死周邊細(xì)胞的凋亡率增加（P＜0.05）。與模型組比較，肝素組和美托洛爾組大鼠心肌梗死周邊細(xì)胞的凋亡率降低（P＜0.05）。見圖2。

圖1 AMI大鼠4周后心肌細(xì)胞（Masson染色×200）

圖2 美托洛爾對(duì)AMI大鼠4周后心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.5 美托洛爾對(duì)AMI大鼠心肌細(xì)胞c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，AMI術(shù)后4周，模型組大鼠心肌細(xì)胞c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)高于假手術(shù)組（P＜0.05）；肝素組、美托洛爾組大鼠心肌細(xì)胞c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)低于模型組（P＜0.05）。見圖3。

2.6 美托洛爾對(duì)AMI大鼠心肌細(xì)胞c-fos、ERK1/2及磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

圖3 AMI大鼠4周后心肌細(xì)胞c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，AMI術(shù)后4周，ERK1/2蛋白表達(dá)各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組大鼠心肌細(xì)胞c-fos、p-ERK1/2蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組（P＜0.05）。肝素組、美托洛爾組大鼠心肌細(xì)胞 c-fos、p-ERK1/2 蛋白表達(dá)低于模型組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 AMI大鼠4周后心肌細(xì)胞c-fos、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)

3 討論

AMI是一種很常見的心血管急癥，雖在西方國(guó)家最為常見，但其在中國(guó)發(fā)病率逐年上升。世界衛(wèi)生組織（WHO）預(yù)測(cè)，到2020年AMI將成為全球第一大導(dǎo)致死亡原因[8]。臨床上常用β-受體阻滯劑治療AMI，其能拮抗兒茶酚胺與β-腎上腺素受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而阻斷興奮和激動(dòng)的傳遞[9-11]。美托洛爾作為一種選擇性β1-受體阻滯藥，在治療AMI時(shí)能降低心臟做功，減少心肌需氧，進(jìn)而減輕心肌損傷程度[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)AMI術(shù)后左心室相關(guān)指數(shù)發(fā)生一系列的變化，4周后Masson和TUNEL結(jié)果顯示：肝素、美托洛爾治療后心肌藍(lán)色膠原減少，心肌纖維化水平降低，且大鼠心肌梗死周邊細(xì)胞的凋亡率降低，說明美托洛爾可以緩解AMI大鼠的心肌損傷程度。

c-fos是一種原癌基因，在細(xì)胞受到刺激后能即刻最先表達(dá)，其編碼的核磷蛋白c-fos不能單獨(dú)起作用，只有與c-Jun蛋白結(jié)合成異源二聚體AP-1，才能活化目標(biāo)基因。c-fos基因在正常的心肌、血管內(nèi)皮和平滑肌中廣泛存在，參與細(xì)胞正常的生長(zhǎng)發(fā)育過程，在應(yīng)激反應(yīng)下有一定的組織保護(hù)作用，但其過度表達(dá)可導(dǎo)致AP-1下游基因腫瘤壞死因子的表達(dá)，造成細(xì)胞凋亡過度[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)[17]，c-fos異常表達(dá)可能是動(dòng)脈粥樣硬化、心肌肥厚以及高血壓的病因之一。大量研究表明[18]，在突發(fā)心肌缺血時(shí)，c-fos表達(dá)上升，轉(zhuǎn)入核內(nèi)后與c-Jun結(jié)合成AP-1調(diào)節(jié)反向基因表達(dá)，將外界信號(hào)轉(zhuǎn)換入胞內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞行為變化。c-fos啟動(dòng)子區(qū)主要有cAMP反應(yīng)組件（CRE）、血清反應(yīng)組件（SRE）與sis誘導(dǎo)組件（SIE），MAPK家族成員ERK1/2與細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)，是將胞外刺激信號(hào)傳遞到胞內(nèi)的共同通路，ERK1/2自我磷酸化后可通過磷酸化Elk-1，從而促進(jìn)三元復(fù)合物SRE/SRF/Elk-1的形成，進(jìn)而誘導(dǎo)c-fos的轉(zhuǎn)錄，其中SRF是血清反應(yīng)因子，因此ERK1/2的表達(dá)及磷酸化是c-fos表達(dá)的先決條件之一[19-21]。

本研究首先復(fù)制AMI大鼠模型，超聲顯示AMI模型大鼠左心室指數(shù)發(fā)生顯著的變化，qRT-PCR結(jié)果顯示心肌組織中c-fos、ERK1、ERK2 mRNA的表達(dá)增加，這說明AMI后大鼠心臟的左心室出現(xiàn)了重塑現(xiàn)象。AMI大鼠服用肝素、美托洛爾后，與模型組相比，左心室心率降低，相關(guān)指數(shù)EF、FS、LVIDd、LVIDs發(fā)生變化程度較小，心肌組織中藍(lán)色膠原減少，心肌纖維化水平降低，細(xì)胞凋亡率下降，同時(shí)c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)較低，c-fos蛋白表達(dá)水平、ERK1/2的磷酸化水平同樣很低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明肝素、美托洛爾可以降低c-fos、ERK1、ERK2的表達(dá)及ERK1/2的磷酸化，抑制信號(hào)在該通路上的傳遞。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明美托洛爾可減輕AMI大鼠后心肌損傷程度，其作用機(jī)制可能與p-ERK1/2-cfos相關(guān)途徑受到抑制有關(guān)。

綜上所述，本研究通過結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支創(chuàng)建AMI模型，采用美托洛爾治療后，AMI大鼠的心肌損傷程度減輕，c-fos、ERK1、ERK2的表達(dá)水平及ERK1/2的磷酸化水平下降，暗示美托洛爾作用機(jī)制可能與p-ERK1/2-c-fos相關(guān)途徑受到抑制有關(guān)。然而AMI大鼠的心肌損傷發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)因素很多、相關(guān)機(jī)制復(fù)雜，美托洛爾緩解心肌損傷的作用機(jī)制還需繼續(xù)深入的探究。