多刺綠絨蒿的組織培養(yǎng)※

●陳序昉 劉聚源 馮虎元（蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 甘肅 蘭州 730000）

●蔣躍明（中國科學(xué)院華南植物園植物資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東 廣州 510650）

多刺綠絨蒿（Meconopsis horridula Hook.f.& Thomas.）屬于罌粟科綠絨蒿屬植物，主要分布于喜馬拉雅山脈一帶[1]。該植物花型美麗，具有重要的觀賞價(jià)值，同時(shí)還具有一定的藥用價(jià)值，如對(duì)心肌缺血性炎癥具有防治效果[2]；同時(shí)在抗腫瘤、抗病毒方面也具有較好效果[3]。在作為傳統(tǒng)藥物方面，根據(jù)《晶珠本草》所記載，多刺綠絨蒿具有廣泛的功效，其中包括對(duì)骨折以及各類顱內(nèi)損傷恢復(fù)具有治療效果。

多刺綠絨蒿生長(zhǎng)需要特殊環(huán)境，面臨引種困難，部分樣地植株分布甚至呈現(xiàn)破片化與板塊化的局面，野外種群也因人為活動(dòng)干擾 (包括西部旅游業(yè)的開發(fā)以及野外藥物的采集)而使其種群正常生存受到威脅[4]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，組織培養(yǎng)已成為繁育植物的有效途徑[5]?？紤]到多刺綠絨蒿具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)結(jié)合野外保護(hù)需要以及可以作為我國東南沿海園藝觀賞需求，有必要對(duì)該植物進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模繁育，進(jìn)而引種栽培。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以多刺綠絨蒿作為研究對(duì)象，分別采集夏瑪林場(chǎng)以及西寧大通縣祁連山保護(hù)區(qū)的多刺綠絨蒿幼株與成株作為外植體；選取生長(zhǎng)活躍的幼嫩葉片等多個(gè)部位作為誘導(dǎo)愈傷組織的實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)中所用的NAA、6-BA以及各種實(shí)驗(yàn)試劑均購于上海伯奧公司，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 消毒 外植體于清水中洗凈后[6]，用酒精棉球?qū)ν庵搀w進(jìn)行擦拭，用少量洗潔精去除幼株表皮毛，然后用0.1%的升汞溶液滅菌3～5分鐘；倒去升汞溶液后，用無菌水沖洗葉片3～4次，每次1分鐘。在無菌環(huán)境下對(duì)外植體進(jìn)行切割，分別將葉片切割成0.5 cm方形小塊，葉柄切成1 cm長(zhǎng)小塊、子房沿底莖縱切后切成0.5～1.0 cm的小塊，生長(zhǎng)點(diǎn)切成直徑0.5 cm的半圓小塊后進(jìn)行接種；花藥則直接接種于培養(yǎng)基上。

1.2.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 外植體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，外源激素控制為0.1 mg/L NAA分別與 1mg/L、3mg/L、5 mg/L 6-BA配合使用[7]，另添加30 g/L的蔗糖和8.6 g/L的瓊脂，調(diào)整pH 5.8～6.0。培養(yǎng)條件：溫度為 20±2℃、光照強(qiáng)度為 1 000～1 200 lux、50～120 lux和完全避光 3 種[8]，24小時(shí)光照。每瓶接種4塊外植體。

1.2.3 外植體繼代培養(yǎng) 選擇愈傷組織萌出前期(接種后第10天)和不再出現(xiàn)愈傷組織時(shí)期（接種后第25天），在此期間每5天進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)。將愈傷組織切割成0.5 cm方形小塊后，切除珠被內(nèi)所有部分，僅保留子房外壁，接入MS培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)培養(yǎng)瓶中接種3～4塊，每組7瓶，進(jìn)行4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。在其余相同條件下組中，每瓶接種3～4塊，每組3瓶，共進(jìn)行4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。愈傷組織誘導(dǎo)率和褐化率的計(jì)算公式如下：

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=(形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100

愈傷組織褐化率（%）=（發(fā)生褐化的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)）×100

繼代愈傷組織萌發(fā)率（%）=（愈傷組織繼續(xù)膨大/接種的愈傷組織總數(shù)）×100

繼代愈傷組織褐化率（%）=（愈傷組織褐化萎縮/接種的愈傷組織總數(shù)）×100

所獲得數(shù)據(jù)采用Excel與Statistics 20軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件對(duì)外植體誘導(dǎo)愈傷組織影響

2.1.1 不同部位保存時(shí)間以及外植體不同發(fā)育時(shí)期對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。 如圖1和表1結(jié)果所示，在相同激素條件下，對(duì)在4℃下分別保存3天、6天、9天、12天、15天、18天和21天的外植體進(jìn)行觀察，當(dāng)外植體在4℃下保存時(shí)間超過15天時(shí)，葉片接入培養(yǎng)基后6天，褐化明顯上升。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，多刺綠絨蒿外植體在4℃下保存不宜超過12天；同時(shí)在本研究中，花托和生長(zhǎng)點(diǎn)在培養(yǎng)過程中未有明顯褐化現(xiàn)象，認(rèn)為其具有誘導(dǎo)愈傷組織的更好潛力，并且以未受粉的成熟子房效果最好。

圖1.不同外植體部位的褐化以及萌發(fā)情況（*p＜0.05，**p＜0.01）

表1 在不同保存時(shí)間下的外植體褐化以及萌發(fā)情況（p＜0.05）

2.1.2 不同濃度6-BA培養(yǎng)對(duì)外植體的影響以多刺綠絨蒿未受粉子房作為外植體，0.1mg/L NAA加不同濃度6-BA添加到MS培養(yǎng)基上。由表2所知，5 mg/L 6-BA培養(yǎng)導(dǎo)致外植體大量發(fā)生褐化并阻礙愈傷組織的形成，隨著6-BA濃度的降低，根與子房壁的誘導(dǎo)率增大；當(dāng)6-BA濃度為1 mg/L時(shí)可超過30%，同時(shí)子房、根以及花托的褐化率明顯下降。另外，隨著6-BA濃度的下降，愈傷組織質(zhì)地變軟同時(shí)發(fā)生膨大，可見，0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA為合適濃度。

表2 不同激素濃度及不同外植體部位褐化以及萌發(fā)情況（p＜0.05）

2.1.3 不同光照條件對(duì)外植體的愈傷組織誘導(dǎo)的影響 由圖2和表3可知，在1000～1200lux全天光照培養(yǎng)可導(dǎo)致外植體褐化率明顯上升，而在50～120 lux光強(qiáng)下培養(yǎng)的外植體萌發(fā)率明顯高于其他條件培養(yǎng)。另外，1 000～1 200 lux全天光照培養(yǎng)6天使褐化率小幅上升，但無顯著性差異，并且發(fā)現(xiàn)在無光條件下未有愈傷組織形成。研究結(jié)果還表明，1000～1200lux 24小時(shí)光照可導(dǎo)致未受粉子房褐化，以50～120 lux弱光環(huán)境有利于未受粉子房的愈傷組織誘導(dǎo)。

圖2 不同光照對(duì)外植體的愈傷組織誘導(dǎo)的影響（*p＜0.05,**p＜0.01）

2.1.4 不同消毒方式對(duì)外植體褐化的影響 從圖3和表3結(jié)果可知，幼株未去除表皮毛組中污染程度明顯上升，但與去除皮刺后相比，無明顯差異。使用酒精浸泡植株也導(dǎo)致褐化率明顯升高，但與含酒精棉球擦拭相比沒有明顯差異。另外，消毒時(shí)間短于4分鐘可使污染率上升。因此，對(duì)多刺綠絨蒿外植體的消毒方式建議去除表皮毛，使用酒精棉球擦拭，升汞處理時(shí)間以超過4分鐘為宜。

圖3 不同消毒方式對(duì)外植體褐化的影響（*p＜0.05,**p＜0.01）

表3 培養(yǎng)15天外植體污染情況

2.1.5 外植體大小對(duì)外植體萌發(fā)率和褐化率的影響 在愈傷組織誘導(dǎo)過程中，未發(fā)現(xiàn)受粉的裸露子房出現(xiàn)萌發(fā)。愈傷組織的萌發(fā)速率受外植體大小影響，并且組織塊過小明顯影響到愈傷組織萌發(fā)率和褐化率，見表4和表5。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，未受粉子房較為適合作為愈傷組織誘導(dǎo)的外植體；同時(shí)如表5結(jié)果所示，當(dāng)作為外植體的子房切割大小為0.7cm×0.4cm×0.4cm時(shí)，外植體愈傷組織萌發(fā)率明顯升高，可認(rèn)為適當(dāng)?shù)耐庵搀w小組織塊可提升愈傷組織的萌發(fā)速率。

表4 外植體大小對(duì)外植體愈傷組織萌發(fā)率以及未褐化率的影響(cm，p＜0.05）

表5 外植體切割大小對(duì)外植體愈傷組織萌發(fā)速度的影響（p＜0.05）

2.2 外植體繼代培養(yǎng)與保存條件

2.2.1 繼代時(shí)間 實(shí)驗(yàn)使用MS培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)。研究結(jié)果見表6，確定多刺綠絨蒿未受粉子房為最適材料。研究還表明，切除子房?jī)?nèi)壁可顯著降低褐化率。另外，子房與根部分別在接種后20天和15天后進(jìn)行繼代培養(yǎng)，外植體褐化率也 顯著下降?？梢?，外植體在萌發(fā)后生長(zhǎng)至一定大小適 合繼代接種培養(yǎng)，并且子房胎座等結(jié)構(gòu)影響到繼代 培養(yǎng)。

表6 外植體繼代處理與時(shí)間對(duì)外植體繼代后外植體褐化率影響（p＜0.05）

2.2.2 外植體保存條件

結(jié)果表明，見圖4。外植體在溫度4℃、土壤含水量在較低濕度下（相對(duì)含水量13.5%）密封袋保存能維持外植體較長(zhǎng)時(shí)間；伴隨著溫度升高，植株出現(xiàn)生長(zhǎng)點(diǎn)/根部出現(xiàn)腐敗，見表7，建議低溫低濕度保存比較適宜。

圖4 外植體保存觀察

表7 外植體保存時(shí)間腐敗情況

3 討論

由于前人對(duì)于多刺綠絨蒿同屬以及其同科植物研究極少，同時(shí)考慮到高原環(huán)境的特殊性以及植株部分部位具有角質(zhì)層增厚等情況，根據(jù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與相關(guān)文獻(xiàn)推測(cè)，并根據(jù)胡選萍相關(guān)綜述文章中提及的外植體自身的生理結(jié)構(gòu)、分化狀態(tài)以及脫分化能力存在差異而導(dǎo)致愈傷組織的誘導(dǎo)率不同[9]，并研究采用不同外植體，以尋找最適合此植株愈傷組織誘導(dǎo)的部位，篩選具有潛力誘導(dǎo)愈傷組織的外植體[10]，確定了多刺綠絨蒿適合作為愈傷組織誘導(dǎo)的外植體部位為子房與根，其他位置可能為外植體生長(zhǎng)點(diǎn)，但未對(duì)激素梯度以及相關(guān)的配比進(jìn)行比較研究。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，已受粉的子房或者放置過久的未離體子房在進(jìn)行誘導(dǎo)過程中，子房壁未見愈傷組織萌發(fā)；經(jīng)觀察，受粉后子房與放置時(shí)間過長(zhǎng)到子房?jī)?nèi)的未成熟種子均出現(xiàn)了不同程度的膨大且子房壁表皮毛特化為皮刺，但子房壁未出現(xiàn)膨大情況，并且子房壁硬化向成熟果莢發(fā)展并發(fā)生褐化。對(duì)比花苞內(nèi)成熟但未受粉子房誘導(dǎo)情況，考慮果實(shí)在成熟過程中整個(gè)過程涉及到果實(shí)褪綠、色素積累、細(xì)胞壁代謝和細(xì)胞膨壓變化以及糖、酸和揮發(fā)物的積累等過程[11]，推測(cè)過長(zhǎng)時(shí)間的冷藏導(dǎo)致了部分物質(zhì)的積累，進(jìn)而使果實(shí)向成熟方向轉(zhuǎn)化。在其他研究中也有報(bào)道，剛成熟的果實(shí)不利于愈傷組織的誘導(dǎo)[12]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)顯示，植物在逆境情況下將導(dǎo)致過氧化物積累，進(jìn)而部分酶系激活，過氧化物酶體在低溫脅迫下呈現(xiàn)出活性先升高后下降的情況，活性整體上升[13]；推測(cè)過長(zhǎng)冷藏時(shí)間導(dǎo)致植物產(chǎn)生逆境響應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致外植體在組織培養(yǎng)過程中發(fā)生褐化，同時(shí)研究表明過氧化物酶活性提高促進(jìn)植株愈傷組織褐化發(fā)生[14]。至于是否子房受粉或植株離開母體后，在保存過程中激活了部分酶系，進(jìn)而導(dǎo)致外植體活性下降，不能有效誘導(dǎo)愈傷組織的形成，需要進(jìn)一步研究闡明。

由于多刺綠絨蒿生長(zhǎng)地的特殊性，為適應(yīng)其環(huán)境，因此，植株在誘導(dǎo)分化過程中需要特殊條件進(jìn)行相關(guān)誘導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)，多刺綠絨蒿愈傷組織在嘗試進(jìn)行再分化誘導(dǎo)過程中，均會(huì)導(dǎo)致發(fā)生褐化而死亡。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)多刺綠絨蒿種子萌發(fā)溫度超過25℃時(shí)，植株萌發(fā)率大幅下降[15]；其他如雪蓮等具有與多刺綠絨蒿類似生境的植株的愈傷組織分化也明顯受環(huán)境溫度的影響[16，17]。因此，在考慮多刺綠絨蒿再分化過程中，需要進(jìn)一步考慮溫度等環(huán)境條件。

目前，無論是細(xì)胞生物反應(yīng)器還是通過愈傷組織，均能獲得類黃酮類次生代謝產(chǎn)物，但面臨愈傷組織離體后遺傳不穩(wěn)定性問題，需要通過合適的繼代培養(yǎng)獲得[18,19]。本研究進(jìn)行了6～8代培養(yǎng)后，出現(xiàn)了組織褐化率升高等情況。有研究表明，植株次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生與培養(yǎng)基濃度以及光質(zhì)有重要的聯(lián)系[20]。根據(jù)本研究結(jié)果，光照條件變化引起愈傷組織保存過程中褐化，因此，對(duì)于優(yōu)化多刺綠絨蒿愈傷組織培養(yǎng)，進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物批量化生產(chǎn)仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究成功建立了多刺綠絨蒿完整的外植體愈傷組織誘導(dǎo)與繼代保存的技術(shù)體系，確定激素配比為0.1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA，保存天數(shù)不超過12天，在50～120lux下全天光照，組織塊大小超過0.7cm×0.4cm×0.4cm，使用酒精棉球與0.1%升汞溶液消毒5分鐘。