清熱解毒方藥含藥血清對脂多糖刺激下人單核細胞MAPK通路的干預(yù)作用

梅 雪 王豪勛 劉曉蕙 裴蘭英

(河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

肺泡巨噬細胞是參與肺部炎癥的主要細胞。脂多糖(LPS)作為革蘭陰性菌的菌體組成成分，是一種強烈的炎癥啟動因子，可引起細胞組織發(fā)生炎癥反應(yīng)、凋亡壞死等。清熱解毒方藥毒素清治療細菌性肺炎療效確切，前期開展動物體內(nèi)試驗，從免疫功能、細胞因子、信號通路等方面揭示該藥治療細菌性肺炎的機制〔1～3〕。本研究以LPS為刺激物，以單核細胞THP-1為研究對象，從重要炎癥信號通路絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路入手，觀察毒素清對LPS刺激下THP-1細胞內(nèi)該通路的影響，為中藥的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物及材料 SD老齡大鼠60只(SPF級)，雌雄各半，平均體重(340±20)g，購于河南省實驗動物中心，合格證號：SCXK〔豫〕2010-0002。細胞株人單核細胞系THP-1細胞株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。毒素清顆粒(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號為130727)，由人參、瓜蔞、白頭翁等組成，每克含生藥量1.66 g。 RPMI1640培養(yǎng)基(Solarbio公司)；胎牛血清(美國Life公司)；LPS(Sigma公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(Solarbio公司)。白細胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-8酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(博士德生物有限公司)。Western印跡主要試劑：P38單克隆抗體、P-P38單克隆抗體(D3F9)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)單克隆抗體(56G8)、P-JNK單克隆抗體(98F2)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)單克隆抗體(137F5)、P-ERK單克隆抗體(D13.14.4E)、β-Tublin單克隆抗體(9F3)、GAPDH單克隆抗體(14C10)(Cell Signaling)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(ZB2306，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2細胞的傳代培養(yǎng) 單核細胞株THP-1接種于含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素，0.05 mmol/L β-巰基乙醇的RPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，每2～3天換液1次，約每3天按1∶3傳代。

1.3含藥血清制備 大鼠隨機分為正常組、毒素清低濃度組、中濃度組、高濃度組，每組15只。每天分別給予等量生理鹽水，低、中、高濃度毒素清(14、28、56 g/kg)灌胃(灌胃劑量=大鼠等效劑量×培養(yǎng)基內(nèi)血清稀釋度)，灌胃容積為10 ml/kg，2次/d，連續(xù)灌胃7次，末次給藥1 h腹主動脈采血，滅活過濾，同組血清混合，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4分組與干預(yù) 取對數(shù)生長期的THP-1細胞接種于96孔板，調(diào)整密度為1 × 108/L，同時加入50 ng/ml佛波酯(PMA)誘導(dǎo)48 h，以孔為單位，分為①空白組(含10%正常大鼠血清的培養(yǎng)液)；②模型組〔含10%正常大鼠血清的培養(yǎng)液+LPS(1 μg/ml)〕；③毒素清低濃度組(低濃度組)；④毒素清中濃度組(中濃度組)；⑤毒素清高濃度組(高濃度組)。③～⑤分別加入10%相應(yīng)組別大鼠含藥血清的培養(yǎng)液+LPS(1 μg/ml)。上述各組各設(shè)5個復(fù)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后，檢測指標。

1.5ELISA檢測細胞因子 收集細胞上清，嚴格按照試劑盒說明書，檢測細胞因子IL-1、IL-6、IL-8。

1.6Western印跡檢測MAPK通路蛋白 提取細胞總蛋白；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量；配膠；以總蛋白含量為30 μg/孔按空白，模型，低、中、高濃度組的順序加樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉(zhuǎn)膜，室溫封閉液中振搖封閉2 h；加一抗4 ℃孵育過夜，Tween-20 Tris-鹽酸緩沖液(TBST)洗膜，與二抗37 ℃孵育1 h，TBST漂洗；電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，曝光照相；結(jié)果用凝膠成像分析軟件分析，采用磷酸化蛋白與總蛋白的灰度值比值進行統(tǒng)計分析。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進行One-Way ANOVA檢驗，方差齊者采用LSD法，方差不齊者采用DunnettT3法。

2 結(jié) 果

2.1毒素清含藥血清對THP-1細胞分泌IL-1β、IL-6、IL-8的影響 與空白組相比，模型組IL-1β、IL-6、IL-8的表達均顯著升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；3個不同濃度的含藥血清組IL-1β、IL-6表達較模型組均顯著降低差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，中高濃度組IL-8表達顯著減少差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與低濃度組相比，中高濃度組IL-1β、IL-6、IL-8的表達均顯著降低差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞IL-1β、IL-6、IL-8、P-P38MAPK、P-JNK、P-ERK的表達比較

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01;與低濃度組比較：4)P<0.05

2.2毒素清含藥血清對THP-1細胞P-P38MAPK、P-JNK46/54、P-ERK42/44表達的影響 模型組細胞P-P38MAPK、P-JNK、P-ERK表達較空白組均顯著升高(P<0.01)；低、中、高濃度組P-P38MAPK、P-ERK的表達較模型組均顯著降低(P<0.01，P<0.05)，其中，中高濃度組表達顯著低于低濃度組(P<0.05)；中高濃度組P-JNK表達較模型組和低濃度組均顯著降低(P<0.01，P<0.05)。見表1，圖1。

A：空白組；B：模型組；C：低濃度組；D：中濃度組；E：高濃度組圖1 各組細胞P-P38MAPK、P-JNK46/54、P-ERK42/44蛋白的表達

3 討 論

細菌性肺炎是臨床常見的肺部感染，具有較高的發(fā)病率和死亡率。中醫(yī)藥治療肺炎已取得了滿意成效，并在減少細菌耐藥性產(chǎn)生和降低抗生素的不良反應(yīng)等方面也具有明顯優(yōu)勢。前期從炎癥通路層面開展的大鼠實驗表明：毒素清能夠改善肺損傷，與其干預(yù)核因子(NF)-κB信號通路，減少炎癥因子分泌有關(guān)〔3〕。巨噬細胞是參與炎癥反應(yīng)的重要細胞。

MAPK通路是參與炎癥反應(yīng)的主要通路之一，包括分別由P38MAPK、JNK、ERK1/2介導(dǎo)的三條級聯(lián)反應(yīng)。LPS作為感染刺激物，作用于單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等細胞表面受體Toll樣受體(TLR)，激活MAPK和NF-κB信號通路，誘導(dǎo)多種炎癥因子如IL-1β、IL-6、IL-8等的合成和釋放，介導(dǎo)炎癥的發(fā)生發(fā)展〔4,5〕。適度的炎癥反應(yīng)對機體是保護性的，但如果炎癥因子過度釋放，則會引起炎癥損傷，抑制炎癥通路可減少炎癥因子的釋放，從而改善炎癥損傷〔6～8〕。在體內(nèi)外實驗中，一種新合成的黃酮LFG-500能夠通過抑制MAPK和NF-κB信號通路減少炎癥因子的分泌，從而減輕急性肺損傷和炎癥反應(yīng)〔9〕。芹黃素可能成為新的炎癥性疾病治療藥物，其作用機制與其通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ，減少TLR4的表達，抑制TLR4介導(dǎo)的MAPK和NF-κB信號通路，減少炎癥因子的分泌有關(guān)〔10〕。本實驗提示，毒素清能夠減少P38MAPK、JNK、ERK蛋白的磷酸化，其作用同樣呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，以中高濃度作用顯著。

綜上，LPS作為感染刺激物作用于單核巨噬細胞，激活了該細胞內(nèi)MAPK信號通路，促進了炎癥因子的分泌。清熱解毒方藥毒素清減輕肺部炎癥損傷的機制與其抑制單核巨噬細胞內(nèi)MAPK通路的活化，降低炎癥細胞因子的表達有關(guān)。