FAK、VEGF-C和LMVD聯(lián)合檢測(cè)判斷直腸癌組織中淋巴管生成的臨床意義

徐永良 張大偉 趙毅玲 馮克儉 孫 平

(牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

直腸癌是發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌的消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，且近年來(lái)發(fā)病率逐年升高〔1,2〕。早期直腸癌以淋巴轉(zhuǎn)移為主〔3〕。淋巴管生成決定是否發(fā)生直腸癌淋巴道轉(zhuǎn)移，直腸癌細(xì)胞能夠通過(guò)局部淋巴管擴(kuò)散到達(dá)遠(yuǎn)處器官，進(jìn)而對(duì)直腸癌患者的預(yù)后產(chǎn)生影響〔4〕。因而，通過(guò)檢測(cè)淋巴管的生成預(yù)測(cè)直腸癌患者的預(yù)后具有重要的臨床意義。黏著斑激酶(FAK)屬于非受體酪氨酸激酶成員之一，在轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮整合素介導(dǎo)信號(hào)的作用，F(xiàn)AK的活化與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系〔5〕。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-C是由腫瘤細(xì)胞分泌的一種特異性的促淋巴管生成因子，通過(guò)與特異性受體結(jié)合誘導(dǎo)淋巴管的生成〔6〕。微淋巴管密度(LMVD)是顯示淋巴管數(shù)量預(yù)測(cè)腫瘤是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要參數(shù)之一。本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)直腸癌組織內(nèi)FAK、VEGF-C和LMVD的表達(dá)，探討三種蛋白表達(dá)的聯(lián)合檢測(cè)評(píng)估對(duì)直腸癌淋巴管生成臨床判定的重要性。

1 資料與方法

1.1病例資料 選取2014年5月至2015年5月牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院胃腸外科收治的直腸癌患者83例，男52 例,女31例，年齡33～76歲。其中高分化腺癌6例，中分化腺癌24例，低分化腺癌53例；漿膜受侵45例,未受侵38例； 52例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，31例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Dukes分期:A、B、C、D期分別有12例，17例，36例，18例。對(duì)照組83例為直腸癌術(shù)后距腫瘤邊緣5～10 cm的正常組織。

1.2檢測(cè)各蛋白表達(dá) FAK兔抗人多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)；VEGF-C、D2-40鼠抗人單克隆抗體、羊抗鼠及羊抗兔二抗試劑盒、防脫載玻片、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(福州邁新生物技術(shù)公司)。所有標(biāo)本甲醛固定、石蠟包埋、4 μm厚度連續(xù)切片，SP染色步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3結(jié)果判斷 細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色為D2-40陽(yáng)性表達(dá)，胞質(zhì)內(nèi)淺黃色至棕褐色染色時(shí)為VEGF-C和FAK 陽(yáng)性表達(dá)。在3個(gè)不同的200倍光鏡視野下對(duì)切片進(jìn)行分析，半定量計(jì)分法判定：①按細(xì)胞質(zhì)染色程度評(píng)分：無(wú)著色且與背景顏色一致為0分；略高于背景顏色的淺黃色為1分；顯著高于背景顏色的棕黃色為2分；棕褐色為3分。②以陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為依據(jù)進(jìn)行評(píng)分：陰性為0分；≤10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。③以陽(yáng)性著色程度與陽(yáng)性細(xì)胞所占比例的乘積為依據(jù)進(jìn)行評(píng)分：(-)0～2 分，(+)3～4 分，()5～8 分，()9～12 分。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1組織D2-40標(biāo)記LMVD結(jié)果 直腸組織D2-40陽(yáng)性染色微淋巴管形態(tài)大小不一，壁較薄，其 LMVD 為(3.9±2.5)；直腸癌組織中明確可見(jiàn) D2-40 陽(yáng)性染色微淋巴管，其 LMVD 為(8.3±2.1)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2直腸癌組織中FAK和VEGF-C表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 83例直腸癌中有55例(66.27%)VEGF-C 呈陽(yáng)性表達(dá)，免疫反應(yīng)物質(zhì)表現(xiàn)為直腸癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒染色，背景不著色；VEGF-C 蛋白的表達(dá)與直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和 Dukes 分期顯著相關(guān)(P<0.01)。FAK 在83例直腸癌中有67例(77.91%)呈陽(yáng)性表達(dá)。主要呈彌漫性或顆粒狀棕黃色位于直腸癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。FAK 的表達(dá)與直腸癌的Dukes 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)(P<0.01)，而與腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度、患者年齡、性別均無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3直腸癌 LVMD與FAK、VEGF-C表達(dá)的相關(guān)性 83例直腸癌標(biāo)本中,LVMD>8.13為高LVMD組。在直腸癌組織中高LMVD與 FAK和VEGF-C的表達(dá)均為正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 直腸癌VEGF-C和FAK的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

與相應(yīng)的亞組比較：1)P<0.01

表2 直腸癌LMVD與FAK、VEGF-C表達(dá)的相關(guān)性(n)

與低LMVD組比較：1)P<0.01

3 討 論

直腸癌轉(zhuǎn)移早期就會(huì)出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。由于直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中淋巴管生成發(fā)揮巨大作用，逐漸獲得了越來(lái)越多的重視和了解。淋巴管的結(jié)構(gòu)和形態(tài)與血管相似，二者常相伴生長(zhǎng)，加大了區(qū)分的難度。因此，淋巴管管腔的識(shí)別及生物學(xué)特性的判定對(duì)研究腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有重要的意義。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)隨著淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)而逐漸提高，腫瘤淋巴管生成作為獨(dú)立的研究領(lǐng)域，正逐漸成為關(guān)注的熱點(diǎn)〔3，7〕。FAK是一種對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分和腫瘤細(xì)胞的黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)均有一定的影響的蛋白質(zhì)〔8，9〕。VEGF-C是一種能與VEGF受體(VEGFR)-3結(jié)合的特異性淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，其具有介導(dǎo)和啟動(dòng)受體的酪氨酸激酶信號(hào)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)淋巴管生成的作用〔10〕。D2-40是目前公認(rèn)的標(biāo)記淋巴管管腔的特異性標(biāo)記物，其顯示的LMVD常用來(lái)研究淋巴管生成在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用。本研究結(jié)果顯示FAK和VEGF-C均高表達(dá)于直腸癌組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。兩者的高表達(dá)均與直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes 分期密切相關(guān)，并且FAK和VEGF-C的表達(dá)與LMVD表達(dá)也具有明顯的相關(guān)性，都提示聯(lián)合檢測(cè)FAK、VEGF-C和LMVD的表達(dá)對(duì)判斷直腸癌內(nèi)淋巴管生成具有重要價(jià)值。這將有利于對(duì)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分析和患者的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，為臨床尋找特異性靶點(diǎn)抑制直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。