69株雞白痢沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性分析

劉洋 ，嚴(yán)專強(qiáng) ，王占新 ，潘海萍 ，陳倫鋒 ， 嚴(yán)麗端 ，覃健萍 ，魯俊鵬 *

（1.廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東 新興 527439；2.廣東溫氏南方家禽育種有限公司，廣東 新興 527439）

雞白痢沙門氏菌具有高度適應(yīng)專一宿主的特點(diǎn)，禽類中雞最易感，可引起雛雞的急性敗血癥，多侵害3周齡以內(nèi)幼雛，發(fā)病率和病死率極高；隨著日齡增加對本病的抵抗力迅速上升，成年雞亦可被感染，常導(dǎo)致母雞產(chǎn)蛋減少，生殖道畸形，體質(zhì)量下降，也導(dǎo)致孵化率和出雛率明顯下降，雞白痢是危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的重要疾病之一[1，2]。本試驗(yàn)在2017～2018年期間從廣東地區(qū)多個(gè)大型種雞場采集樣品進(jìn)行雞白痢沙門氏菌分離鑒定，對分離菌株進(jìn)行了部分藥物的耐藥性分析，以期初步了解廣東區(qū)域雞白痢沙門氏菌流行動(dòng)態(tài)和耐藥性情況，為獸醫(yī)工作者在雞白痢的防治提供參考依據(jù)，為進(jìn)一步控制和凈化雞白痢沙門氏菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基、XLT4瓊脂培養(yǎng)基、藥敏紙片包括氨芐西林、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、磺胺異惡唑甲氧氨芐嘧啶、甲氧氨芐嘧啶和萘啶酸均購自環(huán)凱微生物科技有限公司；Ex Taq酶購自TAKARA。

1.2 病原和細(xì)菌分離 無菌取死胚的卵黃囊、弱雛雞的肝臟，無菌剪碎后分別接至亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）增菌，再取一環(huán)劃線接種于沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基和XLT4培養(yǎng)基，進(jìn)行沙門氏菌的分離鑒定。

1.3 革蘭氏染色鏡檢 挑取純化好的單菌落置于胰蛋白胨大豆肉湯，培養(yǎng)過夜。將菌液涂片固定后，再按結(jié)晶紫初染1min、碘液媒染1min、酒精脫碘30s、蕃紅復(fù)染1min的步驟依次進(jìn)行革蘭氏染色操作，待玻片干燥后在顯微鏡下觀察分離菌株的形態(tài)特征。

1.4 生化鑒定 取適量菌液分別接種于沙門氏菌的生化鑒定管中（三糖鐵、蛋白胨水、尿素、氰化鉀、賴氨酸脫羧酶、甘露醇、山梨醇、β半乳糖苷、衛(wèi)矛醇），24h后觀察并記錄結(jié)果。

1.5 PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank已經(jīng)公布的雞白痢沙門氏菌ipaJ基因的保守核苷酸序列設(shè)計(jì)的雞白痢沙門氏菌的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[3]，20μl反應(yīng)體系：Ex Taq 酶 10μl，無菌水 8μl，上下游引物各 0.5μl，菌液1μl。PCR反應(yīng)程序95℃預(yù)變性 5min；94℃變性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸30s，30循環(huán)；72℃后延伸10min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段為161bp。

1.6 藥敏試驗(yàn) 采用藥敏片法對8種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以測定菌株對抗菌藥物的敏感性和不同菌株之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株形態(tài) 在顯色瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形、光滑凸起的紫紅色菌落，XLT4瓊脂培養(yǎng)基上長出圓形、無色透明的菌落；經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡觀察，分離的細(xì)菌為革蘭氏陰性、兩端鈍圓短桿菌。

2.2 生化鑒定和PCR鑒定結(jié)果 生化試驗(yàn)結(jié)果表明，這69個(gè)分離株在三糖鐵瓊脂（TSI）試驗(yàn)中均產(chǎn)酸、斜面變紅，蛋白胨、尿素、氰化鉀、山梨醇、衛(wèi)矛醇和β-半乳糖苷酶均為陰性，賴氨酸脫羧酶陽性，其中14個(gè)分離株表現(xiàn)為甘露醇陰性，其余分離株均為陽性，參照生化鑒定試劑盒的說明書進(jìn)行判斷，69個(gè)分離株均為沙門氏菌，將其進(jìn)行雞白痢的特異性PCR，69個(gè)分離株均能擴(kuò)增出目的片段。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 69株沙門氏菌對8種藥物的敏感性見下表1所示。由表1可知，50個(gè)分離株表現(xiàn)出多重耐藥，69株受試菌株均對環(huán)丙沙星表現(xiàn)出敏感，10.14%的菌株對氯霉素耐藥，24.64%的菌株對四環(huán)素耐藥，28.99%的菌株對鏈霉素耐藥，57.97%的菌株對氨芐西林耐藥，62.32%的菌株對萘啶酸耐藥，71.01%的菌株對甲氧氨芐嘧啶耐藥，72.46%的菌株對磺胺異惡唑甲氧氨芐嘧啶耐藥。

3 討論

雞白痢是一種急性的系統(tǒng)性疾病，可引起種蛋受精率、孵化率和健苗率降低及死胚率、弱胚率和弱雛率升高等，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。但是目前預(yù)防雞白痢沙門氏菌并無有效的疫苗，只能通過淘汰陽性雞和用藥來控制[4]。因此，需要種雞場嚴(yán)格遵守定期檢疫淘汰制度，淘汰感染雞，做好種雞場的凈化、種蛋消毒、加強(qiáng)雛雞飼養(yǎng)管理、藥物防控和衛(wèi)生措施等環(huán)節(jié)，保持雞舍干燥、清潔，切斷水平傳播和垂直傳播。

本研究在2017～2018年期間成功在廣東地區(qū)分離出69株雞白痢沙門氏菌。藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這69個(gè)分離株對8種藥物的敏感性具有差異，其中所有受試菌株僅對環(huán)丙沙星表現(xiàn)出極度敏感，其他分離株均表現(xiàn)出不同程度的耐藥和多重耐藥，同一地區(qū)分離株之間也具有差異。這與其他關(guān)于雞白痢沙門氏菌的抗菌藥物耐藥結(jié)果類似[5-7]。因此，在臨床用藥預(yù)防和治療某種疾病時(shí)，臨床用藥必須結(jié)合藥敏試驗(yàn)進(jìn)行輪換用藥和聯(lián)合用藥。當(dāng)然，藥物防控是不得已而為之，最重要的還是加強(qiáng)雞場的飼養(yǎng)管理，定期監(jiān)測、淘汰疑似陽性雞，逐步凈化雞群，提高雞群健康度。

表1 分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果