幽門螺桿菌對人組織淋巴瘤細(xì)胞的損傷作用及機(jī)制

宋光永，張曉榮，郭松佳，高艷萍

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，山西汾陽032200)

幽門螺桿菌(Hp)是一種微需氧型的革蘭陰性螺旋桿菌，生存于胃部及十二指腸的各區(qū)域內(nèi)，可引起胃黏膜慢性炎癥，促進(jìn)消化性潰瘍和胃惡性腫瘤的發(fā)展。研究表明，胃癌的發(fā)生與Hp感染呈顯著正相關(guān)，世界衛(wèi)生組織和國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)將Hp明確定義為Ⅰ級致癌物[1，2]。Hp入侵宿主后，相關(guān)炎癥因子如人巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)等表達(dá)升高，并激活胃黏膜相應(yīng)的免疫反應(yīng)，從而刺激單核巨噬細(xì)胞消除Hp[3]。人組織淋巴瘤細(xì)胞屬于單核巨噬細(xì)胞，主要通過分泌腫瘤壞死因子、MIF、單核細(xì)胞趨化蛋白1等炎癥因子產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)，并通過調(diào)節(jié)核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子，共同抵御Hp對機(jī)體的損害[4]。2017年10月，我們采用Hp處理人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系U937，觀察炎癥因子的變化，探討Hp引起慢性炎癥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株由山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部饋贈(zèng)。U937細(xì)胞、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。MIF、IL-1β ELISA試劑盒購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(SYBR Green)、瓊脂糖、Taq酶購于北京天根生物技術(shù)有限公司；核因子κB抑制蛋白α(IκB-α)、NF-κB p65兔抗人抗體、β-actin抗體、CCK-8試劑盒購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株由山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部饋贈(zèng)。U937細(xì)胞、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和MIF、IL-1β ELISA試劑盒、CCK-8試劑盒以及IκB-α、NF-κB p65兔抗人抗體、β-actin抗體購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(SYBR Green)、瓊脂糖、Taq酶購于北京天根生物技術(shù)有限公司。

1.2 Hp培養(yǎng) 以93 mL液體哥倫比亞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、7 mL新鮮脫脂羊血、1 mL混合添加劑制成固體培養(yǎng)基，用接種環(huán)將Hp菌株接種到固體培養(yǎng)基上，置入含O2、N2和CO2的混合氣袋中，37 ℃培養(yǎng)5 d左右。待水珠針尖樣菌體出現(xiàn)后，用接種環(huán)輕輕刮下Hp，加入RPMI1640培養(yǎng)基震蕩混勻，使用紫外分光光度計(jì)測其OD值，1個(gè)OD值相當(dāng)于1×108CFU/mL，得出細(xì)菌母液濃度為1.5×109CFU/mL。

1.3 U937細(xì)胞培養(yǎng)、分組及Hp干預(yù)方法 將細(xì)胞加入RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2氣體培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，待細(xì)胞長滿后用12孔板進(jìn)行多孔培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為Hp組和對照組。Hp組按細(xì)菌與細(xì)胞100∶1的比例加入Hp，對照組加入等體積RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 h。

1.4 細(xì)胞上清中MIF、IL-1β水平檢測 采用ELISA法。取兩組細(xì)胞，離心取上清，檢測MIF、IL-1β水平。按試劑盒說明書以標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MIF、IL-1β表達(dá)量。采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 細(xì)胞MIF、IL-1β、IκB-α、NF-κB mRNA檢測 采用RT-PCR法。收集兩組細(xì)胞，采用TRIzol試劑提取細(xì)胞RNA。測定純度及濃度后，置于-80 ℃保存。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：MIF上游5′-GCAGAACCGCTCCTACAGCA-3′，下游5′-GGCTCTTAGGCGAAGGTGGA-3′，擴(kuò)增片段長度141 bp；IL-1β上游5′-CTTCGAGGCACAAGGCACAA-3′，下游5′-TTCACTGGCGAGCTCAGGTA-3′，擴(kuò)增片段長度108 bp；IκB-α上游5′-GCTGAAGAAGGAGCGGCTACT-3′，下游5′-TCGTACTCCTCGTCTTTCATGGA-3′，擴(kuò)增片段長度72 bp；NF-κB上游5′-CACTTATGGACAACTATGAGGTCTCTGG-3′，下游5′-CTGTCTTGTGGACAACGCAGTGGAATTTTAGG-3′，擴(kuò)增片段長度406 bp；GAPDH上游5′-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3′，下游5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′，擴(kuò)增片段長度251 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s；55 ℃ 20 s延伸；72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。計(jì)算Ct值，應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞毒性觀察 采用CCK-8法。取兩組細(xì)胞，按100 μL/孔加入96孔板中。加入10 μL CCK-8溶液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用分光光度計(jì)測量450 nm處的吸光度OD值，OD值越高代表細(xì)胞的毒性越低、細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)。

1.7 細(xì)胞IκB-α、NF-κB蛋白檢測 采用Western blotting法。使用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取細(xì)胞中的蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。而后進(jìn)行配膠(分為5%濃縮膠和12%分離膠)、上樣、電泳、封閉，以兔抗人IκB-α、NF-κB p65、β-actin抗體為一抗，辣根過氧化物酶酶標(biāo)標(biāo)記為二抗，最后加入ECL顯色液進(jìn)行曝光。以蛋白條帶的灰度值與β-actin的比值作為檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞上清中MIF、IL-1β水平比較 Hp組細(xì)胞上清中MIF、IL-1β水平較對照組升高(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組細(xì)胞上清中MIF、IL-1β水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞MIF、IL-1β、IκB-α、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較 Hp組MIF、IL-1β、IκB-α、NF-κB mRNA表達(dá)水平均較對照組均升高(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組細(xì)胞MIF、IL-1β、IκB-α、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01。

2.3 兩組細(xì)胞毒性比較 Hp組和對照組細(xì)胞的OD值分別為0.17±0.00、0.41±0.05，Hp組較對照組活細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞毒性增強(qiáng)(P<0.01)。

2.4 兩組細(xì)胞NF-κB p65、IκB-α蛋白表達(dá)比較 Hp組細(xì)胞NF-κB p65、IκB-α蛋白表達(dá)水平均較對照組升高(P均<0.05)。見表3。

表3 兩組細(xì)胞NF-κB p65、IκB-α蛋白表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01。

3 討論

Hp是一種微需氧性質(zhì)的革蘭陰性彎狀桿菌，寬0.5～1 μm、長2.5～5 μm，細(xì)胞柱上的鞭毛能促進(jìn)其自身的流動(dòng)，并造成宿主黏膜損傷。目前關(guān)于Hp如何逃脫免疫監(jiān)視導(dǎo)致慢性感染和炎癥的機(jī)制仍未完全闡明[5]。Hp作為致癌因子，在Hp感染機(jī)體后損害胃及十二指腸黏膜，產(chǎn)生TNF-α、白細(xì)胞三烯、IL-1、MIF等，促進(jìn)黏膜的炎癥損傷；隨后炎癥因子趨化活化的人U937細(xì)胞做出及時(shí)的免疫防御反應(yīng)。人U937細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的量會(huì)明顯增加，產(chǎn)生TNF-α、MIF、IL-6、IL-1β等，促進(jìn)機(jī)體黏膜的免疫炎癥損傷[6]。TNF-α、MIF、IL-1β等炎癥因子在慢性炎癥的啟動(dòng)中也是必不可少的[7]，MIF、IL-1β、IL-6可以促進(jìn)結(jié)腸和胃黏膜的慢性炎癥及后續(xù)的癌變過程[8，9]，這些過程主要與STAT1和STAT3的過度激活有關(guān)[10]；同時(shí)在炎癥因子發(fā)生作用的時(shí)候能夠誘導(dǎo)DNA的慢性損傷從而導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞的凋亡[11]。

目前，關(guān)于Hp以及Hp刺激巨噬細(xì)胞的研究較多，但有關(guān)Hp感染人組織淋巴瘤細(xì)胞的研究并不多。Hp作為一級致癌物質(zhì)，已經(jīng)引起格外關(guān)注。本研究結(jié)果顯示，Hp組炎癥因子MIF、IL-1β的分泌量較對照組增加，表明Hp感染巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞后，能夠促進(jìn)U937細(xì)胞炎癥因子MIF、IL-1β分泌，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體做出一定的免疫防御反應(yīng)，間接性抑制菌體對感染者的進(jìn)一步損害。Hp感染后人U937細(xì)胞的毒性增強(qiáng)，這可能與細(xì)胞炎癥因子分泌量增多有關(guān)。Hp組MIF、IL-1β、IκB-α、NF-κB mRNA表達(dá)水平均較對照組升高，證實(shí)炎癥因子表達(dá)升高，更進(jìn)一步說明了細(xì)胞毒性升高的原因和機(jī)制，即人U937細(xì)胞經(jīng)Hp感染后直接引起了細(xì)胞炎癥因子分泌量的增加及細(xì)胞毒性的加強(qiáng)。

NF-κB是由p50和p65亞基組成的異源性質(zhì)的二聚體[12]，是正常表達(dá)在許多細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一種重要的多功能核轉(zhuǎn)錄因子，其激活后參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在炎癥、免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激等過程中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路激活后能夠誘導(dǎo)炎癥因子如IL-1β、MIF、TNF-α等過度表達(dá)，使得炎癥反應(yīng)加劇[13]。本研究結(jié)果顯示，Hp組細(xì)胞NF-κB p65、IκB-α蛋白表達(dá)水平較對照組升高，表明Hp感染巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞后，激活了NF-κB信號(hào)通路，在此基礎(chǔ)上調(diào)控Hp對宿主黏膜的免疫炎癥損傷。

綜上所述，Hp感染人組織淋巴瘤細(xì)胞后可誘導(dǎo)MIF、IL-1β等炎癥因子分泌增加，加速NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)而引起重要信號(hào)通路蛋白NF-κB p65、IκB-α表達(dá)升高，最終形成一個(gè)完備的炎癥微環(huán)境，擾亂機(jī)體的免疫防御反應(yīng)，導(dǎo)致胃黏膜慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展。