肝癌組織中SMARCC1 mRNA表達(dá)變化及其對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的影響

柯少波，邱虎，石薇，陳佳梅，陳永順

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060)

染色質(zhì)重塑是指染色質(zhì)通過動(dòng)態(tài)變化的結(jié)構(gòu)影響基因組DNA、核小體中組蛋白及轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)控核內(nèi)DNA復(fù)制、修復(fù)和重組，染色質(zhì)重塑是表觀遺傳學(xué)的一個(gè)重要方面[1，2]。染色質(zhì)重塑復(fù)合體SWI/SNF在20%的肝癌患者中存在亞基突變，因此SWI/SNF在肝癌細(xì)胞中的發(fā)生和發(fā)展可能是一種普遍機(jī)制[3，4]。文獻(xiàn)報(bào)道，SWI/SNF復(fù)合體包含多個(gè)ATP酶相關(guān)的亞基，包括SMARCA4、SMARCA2、SMARCB1、SMARCC1等[5]，SWI/SNF亞基突變?cè)斐删幋a蛋白的失活以及復(fù)合體功能異常，從而誘發(fā)腫瘤發(fā)生，可能是一種癌基因。我們的前期研究表明，高遷移率組蛋白B(HMGB1)通過下調(diào)靶基因SMARCC1抑制乳腺癌細(xì)胞的生存和轉(zhuǎn)移[6]。SMARCC1作為染色質(zhì)重塑復(fù)合體亞基之一，在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制不明。本研究觀察了肝癌組織中SMARCC1的表達(dá)變化，然后通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察下調(diào)SMARCC1對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響，探討SMARCC1對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年3月～2017年6月在我院行手術(shù)治療的62例肝癌患者，男34例，女28例，年齡(58.7±3.6)歲。AJCC分期Ⅰ期5例，Ⅱ期12例，Ⅲ期26例，Ⅳ期19例。肝功能Child-Pugh分級(jí)A級(jí)5例，B級(jí)32例，C級(jí)25例。合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移19例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移43例。取手術(shù)切除的肝癌組織和癌旁組織(距癌組織2 cm以上)，置入液氮保存。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 肝癌與癌旁組織中SMARCC1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。取肝癌組織和癌旁組織，加入TRIzol試劑提取組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Sybr Green Master Mix(Thermo公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min，94 ℃變性40次，15 ℃退火，60 ℃退火1 min。以β-actin作為內(nèi)參。SMARCC1引物序列：上游5′-GAAGCAGCCAAGCACAGTTTGTAG-3′，下游5′-CAATACCCATGTCAGAGGCAGCA-3′。β-actin引物序列：上游5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3。

1.3 SMARCC1 siRNA設(shè)計(jì)與合成 利用生物信息學(xué)工具選取SMARCC1 siRNA序列為：有義鏈5′-ACUCAUUGGUUCCUUUAAGGG-3′，反義鏈5′-CUUAAAGGAACCAAUGAGUCC-3′；陰性對(duì)照物序列為：有義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈5′-ACGUGA-CACGUUCGGAGAATT-3′。SMARCC1 siRNA及陰性對(duì)照物由廣州銳博生物有限公司合成。采用LipofectamineTMRNAiMAX(美國Invitrogen公司)將SMARCC1 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，直接沉默細(xì)胞SMARCC1 mRNA表達(dá)。

1.4 肝癌細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染 肝癌HepG2細(xì)胞購自武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心，細(xì)胞解凍后加入DMEM(含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗)，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將其分為觀察組和對(duì)照組，觀察組轉(zhuǎn)染SMARCC1-siRNA，對(duì)照組轉(zhuǎn)染siRNA陰性對(duì)照物。將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置于6孔板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%左右融合度時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。取兩組細(xì)胞接種于6孔板中，用100 μL槍頭垂直于孔板制作細(xì)胞劃痕，盡量保持各個(gè)劃痕寬度一致。用PBS清洗劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于實(shí)驗(yàn)0、12 h拍照，采用Image J軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕寬度-12 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.6 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。向Transwell小室上室中加入稀釋后的Matrigel，37 ℃無菌環(huán)境下放置1 h。取兩組細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化，制成5×105/mL的細(xì)胞懸液，每個(gè)小室中加入100 μL細(xì)胞懸液，下室中每孔加入500 μL有血清培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。取出小室，用棉簽擦掉小室內(nèi)部未穿過底膜的細(xì)胞。加入多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫溶液染色。顯微鏡下(×200)隨機(jī)選取8個(gè)視野，計(jì)數(shù)紫色染色的穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.7 細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。提取細(xì)胞總蛋白，配置SDS-PAGE分離膠和濃縮膠，加樣，電泳，濃縮膠80 V電泳35 min，分離膠100 V電泳90 min，分離蛋白。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉1 h后，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗孵育1 h，TBST洗膜。化學(xué)發(fā)光法顯影，Image J圖像處理軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織與癌旁組織中SMARCC1 mRNA表達(dá)比較 肝癌組織和癌旁組織中SMARCC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.559±0.562、0.468±0.274，肝癌組織中SMARCC1 mRNA表達(dá)高于癌旁組織(P<0.01)。

2.2 兩組細(xì)胞遷移能力比較 觀察組細(xì)胞遷移率為43.9%±5.6%，對(duì)照組為92.5%±6.7%，觀察組細(xì)胞遷移率低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 兩組細(xì)胞侵襲能力比較 觀察組穿膜細(xì)胞數(shù)為(26.13±0.89)個(gè)，對(duì)照組為(76.75±2.64)個(gè)，觀察組穿膜細(xì)胞數(shù)少于對(duì)照組(P<0.01)。

2.4 兩組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)比較 觀察組MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

肝癌是多基因、多步驟參與的復(fù)雜進(jìn)展過程[7～9]。近年來，隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，肝癌的基因治療已成為繼手術(shù)、化療、介入治療后具有巨大前景的治療方式[10]。染色質(zhì)重塑復(fù)合體變異在肝癌中的作用逐漸受到重視，以沉默相應(yīng)變異基因?yàn)橥黄泣c(diǎn)，有望開發(fā)新型的基因治療藥物。SMARCC1是染色質(zhì)重塑復(fù)合體亞基之一，在多種腫瘤發(fā)展中起關(guān)鍵作用[11]。本研究結(jié)果顯示，SMARCC1在肝癌組織中呈高表達(dá)，表明SMARCC1與肝癌的發(fā)病有關(guān)。

Wang等[12]研究表明，SMARCC1在乳腺癌、前列腺癌中均呈高表達(dá)，且細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，內(nèi)源性的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。Heeb?ll等[13]研究表明，SMARCC1在前列腺癌組織中呈高表達(dá)，SMARCC1表達(dá)與前列腺癌復(fù)發(fā)、淋巴轉(zhuǎn)移及病理Gleason分級(jí)呈正相關(guān)。Iwagami等[14]研究表明，miR-320c通過抑制靶基因SMARCC1促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的活性，并逆轉(zhuǎn)了人胰腺癌耐藥細(xì)胞系MiaPaCa2的耐藥性。本研究通過下調(diào)肝癌細(xì)胞的SMARCC1 mRNA表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，結(jié)果表明，肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到抑制。這與以往SMARCC1在其他惡性腫瘤中的研究結(jié)果相吻合。因此認(rèn)為，SMARCC1可能是一種癌基因，參與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

MMP異常高表達(dá)是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的經(jīng)典機(jī)制之一。MMP-2和MMP-9屬于MMP家族成員，在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要意義。MMP-2和MMP-9參與了腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)代謝，能降解腫瘤細(xì)胞基底膜的Ⅳ型膠原，破壞正常組織結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Li等[15]研究表明，轉(zhuǎn)錄因子FOXA2能夠靶向下調(diào)MMP-2基因，從而抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)SMARCC1 mRNA表達(dá)后，肝癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平降低，表明SMARCC1可能介導(dǎo)MMP調(diào)控骨肉瘤侵襲能力。

綜上所述，肝癌組織中SMARCC1 mRNA表達(dá)升高；下調(diào)SMARCC1 mRNA表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與MMP-2、MMP-9表達(dá)降低有關(guān)。