葉酸修飾氧化石墨烯裝載松針木栓酮聯(lián)合微波釋藥的抗腫瘤研究

李啟照，錢(qián)溪溪，陶方紅

(安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088)

胃癌在我國(guó)各種惡性腫瘤中居首位，目前主要是通過(guò)手術(shù)治療切除病灶部位或化療放療進(jìn)行醫(yī)治，對(duì)人體傷害極大.研究表明，植物活性成分黃酮類(lèi)化合物可通過(guò)抗氧化、激素調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，療效確切[1].雪松是松科雪松屬植物的總稱(chēng)，具有活血消腫、祛風(fēng)活絡(luò)、抗菌、抗病毒以及抗氧化等功效[2].葉酸修飾的氧化石墨烯是一種很有前途的靶向抗癌藥物載體[3].而微波釋藥則廣泛應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞抑制的輔助治療.本實(shí)驗(yàn)是利用氧化石墨烯葉酸組裝松針木醛酮進(jìn)行SGC-7901抑制胃癌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究，目的是為松針活性成分的抗胃癌作用研究提供研究參考.

1 材料與方法

1.1 材料

雪松(Cedrusdeodara)松針采自中國(guó)安徽省大別山金寨縣；天然鱗片石墨粉(粒徑約為40～50 μm)，純度99.9%，青島歐爾石墨有限公司；葉酸，氮-羥基琥珀酰亞胺，sigma；1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺，Aldrich；透析袋，寬度34 mm，容量3.4 mL/cm，截留分子量8 000～14 000，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃癌細(xì)胞系SGC-7901，安徽醫(yī)科大學(xué)；RPMI-1640 培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)，上海尚寶生物科技有限公司；MTT試劑盒，上海碧云天生物科技有限公司；其余試劑均為分析純.

1.2 儀器

水平搖床，北京六一儀器有限公司；電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；sigma超速冷凍離心機(jī)，德國(guó)sigma公司；85-2A 控溫恒速攪拌器，上海德洋意邦儀器有限公司；JY98-III 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；PS-100A 超聲波清洗器，昆山超聲波清洗器有限公司；美國(guó)Agilent 6890N氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測(cè)器；酶標(biāo)儀(BXS01-ELx-800)，美國(guó)寶特酶標(biāo)儀；VG Auto-Spec-3000質(zhì)譜儀，英國(guó)Micromass公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 松針木栓酮的制備與純化

雪松松針干燥粉末(約2.5 kg)用95%乙醇(4×8 L)提取，減壓濃縮至無(wú)乙醇?xì)馕叮铀畱腋?，分別用石油醚(3×4 L)、氯仿(3×4 L)、乙酸乙酯(3×4 L)和正丁醇(3×4 L)依次萃取，減壓濃縮得浸膏,其中,石油醚部分42.0 g、氯仿部分39.0 g、乙酸乙酯部分85.0 g，正丁醇部分187.0 g.

乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱色譜，得6個(gè)部分(Fr.1～Fr.6).Fr.5經(jīng)減壓濃縮得到黑色浸膏，反復(fù)硅膠色譜(氯仿：甲醇為9：1～5：5，v/v)，用Sephadex LH-20凝膠柱(氯仿：甲醇為1：1，v/v)純化，得到木栓酮18.7 mg.

1.3.2 氧化石墨烯(GO)的制備與純化

氧化石墨烯采用Hummers制備：移取200 mL濃硫酸，在冰浴條件下放置一段時(shí)間，使其溫度接近冰浴溫度.在不斷攪拌的條件下將5 g石墨粉加入到濃硫酸中，再稱(chēng)取18 g高錳酸鉀加入到濃硫酸里，保持冰浴條件下攪拌3 h，使之混勻.從冰浴中取出反應(yīng)液，并在室溫條件下繼續(xù)攪拌5 d，回到冰浴條件下，然后加入18 g高錳酸鉀，持續(xù)攪拌3 h重復(fù)上述步驟一次.量取46 mL水，逐滴緩慢加入，使混合物保持較低溫度，然后將其放在90～100 ℃水浴中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)30 min，從熱水浴中取出后加入140 mL水和30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的雙氧水，待變?yōu)榱咙S色后，混勻離心分離，最后分別使用無(wú)水乙醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%鹽酸對(duì)離心產(chǎn)物進(jìn)行離心清洗至中性，在恒溫干燥箱50 ℃下烘干即得到氧化石墨烯.

取適量干燥后的氧化石墨烯，加入50 mL蒸餾水，在冰浴條件下，使用超聲粉碎機(jī)在500 W的功率下對(duì)混合物進(jìn)行超聲震蕩1 h，獲得棕黃色的分散液，將分散液在12 000 r/min下離心15 min，收集棕黃色上清液，將沉淀再次加入到蒸餾水中，重復(fù)上述步驟，最終得到氧化石墨烯水溶液.

在氧化石墨烯的水溶液中加入適量蒸餾水，再用截留分子量為8 000～14 000的透析袋透析2 d，獲得的濾液即為氧化石墨烯的分散液.

1.3.3 葉酸修飾氧化石墨烯制備

向氧化石墨烯分散液中依次加入5 g NaOH，5 g NaClO，超聲處理2 h.待反應(yīng)完全后用稀鹽酸對(duì)溶液進(jìn)行重復(fù)漂洗，漂洗完成后，將反應(yīng)液分離，在8 000 r/min的條件下離心20 min，去除沉淀，獲得上層黑色溶液.將收集到的黑色溶液用蒸餾水透析48 h，去除未反應(yīng)的物質(zhì).

向透析液中加入0.5 g葉酸，超聲處理使其均勻分散.在攪拌條件下加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和氮-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，超聲處理2.5 h后使用NaHCO3溶液(pH=8)對(duì)混合液進(jìn)行透析處理48 h，每4 h更換一次NaHCO3溶液，將得到的黑色溶液使用旋蒸儀去除其中的水分，使用丙酮對(duì)黑色沉淀進(jìn)行反復(fù)洗滌，于40 ℃下真空干燥，得到氧化石墨烯葉酸修飾物，記為FA/GO.

1.3.4 松針黃酮(PNF)對(duì)FA/GO的負(fù)載實(shí)驗(yàn)

將0.05 g FA/GO加入到50 mL乙醇中，超聲0.5 h使其分散，然后向分散液中緩慢滴入1 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的松針木栓酮，避光攪拌24 h，待反應(yīng)完全后將燒杯中的合成液在12 000 r/min條件下離心1.5 h，去除沉淀物，可得負(fù)載了松針木栓酮的FA/GO分散液，記為FA/GO/PNC，利用氣相色譜法可計(jì)算出負(fù)載在分散液上的松針木栓酮的量.計(jì)算公式為

FA/GO/PNC上的松針木栓酮量=初始加入的松針木栓酮含量—上層清液中松針木栓酮含量，

式中：上層清液中的松針木栓酮含量可通過(guò)氣相色譜法測(cè)量離心后上層清液480 nm，然后對(duì)照繪制的松針木栓酮標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線后計(jì)算所得.離心后下層物質(zhì)在恒定溫度為30 ℃的真空干燥箱中干燥12 h.

1.3.5 FA/GO/PNC中松針木栓酮的緩釋實(shí)驗(yàn)

取干燥后的FA/GO/PNC作為樣品加入到乙醇中，混合后裝入透析袋中，扎緊，移入1 000 mL錐形瓶，加入300 mL乙醇于錐形瓶中，置于恒溫超聲儀中，保溫37 ℃.利用微波輻射儀對(duì)錐形瓶中的藥物進(jìn)行輻射，設(shè)置微波功率為20～200 W，輻射時(shí)間為30～300 s,每隔30 s取1 mL透析袋外的乙醇，并加入1 mL乙醇，以保證瓶中乙醇總體積不變.氣相色譜法檢測(cè)其濃度.另一組不給予微波輻射儀處理.繪制松針木栓酮濃度-峰面積曲線，并根據(jù)這個(gè)曲線獨(dú)處ti時(shí)刻取出的乙醇中的木栓酮濃度Cti，按照下列公式計(jì)算出松針木栓酮的累積釋放率(S%).

S%=(CtiVti+∑CtiVti)/(C0V0-C1V1)×100，

其中：S%表示釋放量，V表示乙醇的體積，C0表示初始加入的松針木栓酮的濃度，V0表示初始加入的松針木栓酮的體積，C1表示載藥后經(jīng)離心所得的上清液中藥物濃度，V1表示載藥后經(jīng)離心所得的上清液體積，Ct表示t時(shí)刻取出的乙醇中藥物的濃度，Vt表示t時(shí)刻取出的乙醇的體積.

1.3.6 FA/GO/PNC與FA/GO對(duì)胃癌細(xì)胞的體外抑制實(shí)驗(yàn)

胃癌細(xì)胞SGC-7901接種于完全培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng).取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞SGC-7901制備細(xì)胞懸液，每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于 96 孔板中，每孔加入 100 μL完全培養(yǎng)液待24 h細(xì)胞貼壁后吸盡完全培養(yǎng)液.空白組組加入完全培養(yǎng)液，陰性組分別加入濃度為.0.5、1、2、4、8 μg/mL的FA/GO完全培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為 0.5、1、2、4、8 μg/mL的FA/GO/PNC完全培養(yǎng)液，每個(gè)處理組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，微波處理?xiàng)l件下分別置于培養(yǎng)箱24h后，每孔加MTT溶液(5 μg/mL用PBS配制，pH=7.4)20 μL.孵育4 h終止培養(yǎng)，輕輕吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)上清液.每培養(yǎng)孔內(nèi)加入150 μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解.酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 波長(zhǎng)處的吸光值(OD) .實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次.按以下公式計(jì)算FA/GO/PNC對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率.

細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照組OD-陰性組OD)/對(duì)照組OD×100.

1.3.7 Western blot法

根據(jù)MTT法結(jié)果，分別使用2 μg/mL FA/GO/PNC、FA/GO和完全培養(yǎng)基聯(lián)合微波處理胃癌細(xì)胞SGC-7901 48 h，提取蛋白質(zhì)后采用BCA法測(cè)定其總蛋白含量.分別取各組40 μg總蛋白上樣，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入適量Bax(1:1 000)、β-actin(1：2 000)、Akt(1：1 000)或p-Akt(1：1 000)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗(1：4 000)，室溫下?lián)u蕩孵育2 h，采用ECL發(fā)光液發(fā)光，X線片壓片、顯影、定影.采用Gel-Pro analyzer分析各顯影條帶的 A值(p-Akt與Akt的A值比值，Bax與β-actin的A值比值).

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 松針木栓酮結(jié)構(gòu)式

白色固體(乙醇)；ESI-MS正離子模式下給出準(zhǔn)分子離子峰m/z：428 [M + H]+，450 [M + Na]+，其相對(duì)分子質(zhì)量為427.結(jié)合其N(xiāo)MR數(shù)據(jù)，推斷分子式為C30H50O，1H-NMR (CDCl3，500 MHz)δ：1.97 (1H，m，H-1a)，1.70 (1H，m，H-1b)，2.38 (1H，dd，J=13.3，4.8 Hz，H-2a)，2.32 (1H，dd，J=13.1，7.3 Hz，H-2b)，2.23 (1H，d，J=6.3 Hz，H-4)，1.75 (1H，m，H-6)，0.87 (3H，s，H-23)，0.76 (3H，s，H-24)，0.88 (3H，s，H-25)，0.99 (3H，s，H-26)，1.00 (3H，s，H-27)，1.14 (3H，s，H-28)，1.03 (3H，s，H-29)，0.97 (3H，s，H-30)；13C-NMR (CDCl3，125 MHz).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定為木栓酮，見(jiàn)圖1.

2.2 FA/GO對(duì)松針木栓酮的負(fù)載實(shí)驗(yàn)

將松針木栓酮作為藥物模型分析松針木栓酮在FA/GO上的負(fù)載效果，結(jié)果表明，F(xiàn)A/GO對(duì)松針木栓酮的負(fù)載率為67.2%，即每0.05 g FA/GO可負(fù)載1.34 g松針木栓酮.FA/GO與未經(jīng)修飾的氧化石墨烯相比，載藥率相差較小.

2.3 FA/GO/PNC的藥物緩釋研究

FA/GO上負(fù)載的松針木栓酮在微波處理?xiàng)l件下對(duì)其藥物釋放過(guò)程進(jìn)行觀察，如圖2所示.在160 h內(nèi)藥物的釋放率呈遞增趨勢(shì)，具有較好的緩釋性.當(dāng)釋放160 h時(shí)，在微波處理?xiàng)l件下，藥物的累積釋放率為45.68%；而當(dāng)不用微波處理時(shí)，藥物的累積釋放率為33.46%.并且在40～160 h內(nèi)，在微波處理?xiàng)l件下藥物的釋放率較高.

2.4 FA/GO/PNC與FA/GO對(duì)胃癌細(xì)胞的體外抑制實(shí)驗(yàn)

采用胃癌細(xì)胞系SGC-7901作為模型，對(duì)FA/GO/PNC和FA/GO對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率進(jìn)行了研究，見(jiàn)圖3.結(jié)果表明當(dāng)FA/GO/PNC濃度為8 μg/mL時(shí)，對(duì)胃癌細(xì)胞系SGC-7901的抑制率達(dá)到86.12%.而且當(dāng)FA/GO濃度為8 μg/mL時(shí)，抑制率為30.85%，眾所周知，微波對(duì)癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，故證明FA/GO作為藥物載體具有一定的安全性.

圖2 微波處理和無(wú)微波處理下的藥物釋放曲線

圖3 FA/GO/PNC與FA/GO對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率

2.5 FA/GO/PNC對(duì)bax蛋白及PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

Western結(jié)果顯示:當(dāng)使用2 μg/mL FA/GO/PNC聯(lián)合微波處理胃癌細(xì)胞系SGC-7901 48 h后,Bax蛋白表達(dá)比值明顯上升，而P-Akt/Akt比值明顯下降，F(xiàn)A/GO組與空白組Bax蛋白表達(dá)比值和P-Akt/Akt比值均無(wú)明顯差異.

3 結(jié)論

采用葉酸修飾氧化石墨烯后裝載松針木栓酮，聯(lián)合微波釋藥法利用MTT法，以胃癌細(xì)胞SGC-7901為模型，考察了一種新型的以氧化石墨烯為基礎(chǔ)的藥物載體(FA/GO)的載藥能力、在于微波聯(lián)用下緩釋能力、對(duì)癌細(xì)胞的抑制率，以及對(duì)PI3k/Akt信號(hào)通路的影響，獲得了較好結(jié)果，該材料對(duì)松針木栓酮的載藥率為67.2%，具有較好的應(yīng)用前景.在運(yùn)用微波聯(lián)合處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，微波對(duì)該載體系統(tǒng)釋藥具有較強(qiáng)作用，可對(duì)胃癌細(xì)胞起到一定的直接抑制作用.

實(shí)驗(yàn)采用FA/GO/PNC聯(lián)合微波處理胃癌細(xì)胞系SGC-7901后，P-Akt/Akt蛋白比例明顯下降，提示松針木栓酮可能通過(guò)抑制PI3k/Akt信號(hào)通路，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖.松針作為藥材研究并不多，而木栓酮這一類(lèi)氧化環(huán)烷烴類(lèi)化合物因?yàn)槠淙芙庑暂^差，故其抗癌效果的研究也較少.該實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建GA/GO/PNC，既解決了松針木栓酮溶解性較差的問(wèn)題，又通過(guò)聯(lián)合微波局部照射，做到了藥物地靶向釋放，為傳統(tǒng)藥物化合物的提取及制劑提供了新的研究思路.