不同制劑對(duì)茖蔥種子發(fā)芽和直接分化不定芽誘導(dǎo)的影響

張麗娟　曲繼松　朱倩楠　李堃

摘 要： 為探索茖蔥種子萌發(fā)條件及其對(duì)PEG-8000處理的響應(yīng)，同時(shí)測(cè)定不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方對(duì)茖蔥不定芽分化的影響。以前一年和當(dāng)年茖蔥種子為材料，采用培養(yǎng)皿濾紙卷法進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)；以茖蔥鱗莖為外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)分化。結(jié)果表明，10%（w）的PEG-8000處理可明顯促進(jìn)前一年茖蔥陳種子發(fā)芽，發(fā)芽率94.00%、發(fā)芽指數(shù)0.89。隨PEG-8000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，茖蔥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)有所降低；低溫層積50 d及PEG-8000浸種能顯著促進(jìn)茖蔥當(dāng)年新種子萌發(fā)，沙藏層積50 d，再用200 mg·L-1 PEG-8000浸種4 h，發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間及發(fā)芽高峰期提前最多，發(fā)芽持續(xù)時(shí)間縮短10 d左右，與CK相比，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)分別提高了475.00%、65.52%及93.75%，對(duì)促進(jìn)茖蔥種子發(fā)芽的效果最好，同時(shí)PEG-8000浸種能顯著減少種子層積后的爛種數(shù)。篩選出MS+6-BA 1.5 mg·L-1 +2，4-D 1.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1為供試方案中的最優(yōu)培養(yǎng)基配方，分化率為56.56%。

關(guān)鍵詞： 茖蔥； 種子發(fā)芽； PEG-8000； 直接分化； 不定芽誘導(dǎo)

Effect of different preparations on induction of adventitious buds on the germination and direct differentiation of Allium victorialis L. seeds

ZHANG Lijuan， QU Jisong， ZHU Qiannan， LI Kun

（Institute of Germplasm Resources， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Science， Yinchuan 750002， Ningxia， China）

Abstract： In order to explore the germination conditions of the seeds and the response to PEG-8000 treatment， and the effect of different plant growth regulator combinations on Allium victorialis L. adventitious buds induction， Allium victorialis L. seeds of last year and the new one were taken as materials. The seed germination test was carried out with culture dish filter paper. Bulbs of Allium victorialis L. were used as explants for adventitious buds inducted differentiation. The results indicated that the 10% PEG-8000 treatment can obviously promote the germination of old seed. The germination rate was 94.00% and the germination index was 0.89. The germination rate， germination potential and germination index were decreased with the increasing the concentration of PEG-8000. The cold stratification of 50 days and PEG-8000 immersion can significantly promote the germination of the new seeds.The immersion for 4 h with 200 mg·L-1 PEG-8000 after 50 days of sand accumulation layer ， can make the start time and the peak of germination come earlier. The period of germination was reduced by 10 days， compared with CK， germination potential， germination rate and germination index increased by 475.00%， 65.52% and 93.75% respectively， the promotion effect of seed germination was the best. At the same time， PEG-8000 immersion can significantly decreased the number of decomposed seeds after lamination. The formula of MS+6-BA 1.5 mg·L-1+ 2，4-D 1.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1 was selected as the optimal medium in the test， and the differentiation rate was 56.56%.

Key words： Allium victorialis L.； Seed germination； PEG-8000； Direct differentiation； Adventitious buds induction

茖蔥（Allium victorialis L.）為百合科（Liliaceae）蔥屬多年生草本植物，別名寒蔥、鹿耳蔥、隔蔥等，全株可供食用，為藥食兼用植物，其蔥香味濃，并略帶爽口野味，為一種珍稀山野菜[1]。近年來(lái)，由于其特殊的營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值日益受到人們的重視[2-4]。茖蔥生長(zhǎng)環(huán)境特殊，供應(yīng)周期較短，季節(jié)性強(qiáng)，繁育能力差，連根挖起的采集方式致使野生茖蔥資源遭到嚴(yán)重破壞，數(shù)量急劇減少[5-7]。茖蔥的實(shí)生繁殖較困難，正常條件下茖蔥種子發(fā)芽慢且所需時(shí)間長(zhǎng)，具有上胚軸休眠特性。茖蔥分株繁殖同樣較困難，很難得到大量繁殖體[8]。茖蔥產(chǎn)業(yè)在我國(guó)還比較落后，不能充分有效地保證市場(chǎng)日益擴(kuò)大的需求。目前我國(guó)關(guān)于茖蔥繁殖的研究報(bào)道較少，茖蔥種子萌發(fā)慢、不整齊的特性仍需進(jìn)一步改善；另外，組織培養(yǎng)是茖蔥進(jìn)行無(wú)性快速繁殖的方法之一。筆者對(duì)茖蔥種子進(jìn)行不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方處理，通過(guò)種子發(fā)芽試驗(yàn)篩選最優(yōu)處理方式；通過(guò)應(yīng)用不同培養(yǎng)基配方進(jìn)行茖蔥不定芽誘導(dǎo)，探索茖蔥直接分化不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，以期為茖蔥的有性、無(wú)性繁殖以及規(guī)?；娜斯ゑZ化栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

茖蔥種子采集于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜試驗(yàn)基地，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院宋述堯教授鑒定。發(fā)芽試驗(yàn)時(shí)間為2016年10月，試驗(yàn)一的種子為2015年采集的陳種子，試驗(yàn)二的種子為當(dāng)季新種子；不定芽誘導(dǎo)的茖蔥材料于2017年4月中旬采自寧夏農(nóng)林科學(xué)院園林場(chǎng)綜合試驗(yàn)基地馴化栽培的茖蔥全株（2015年10月引自吉林）。

1.2 種子處理

將茖蔥種子設(shè)置PEG-8000和PEG-8000+層積處理2個(gè)試驗(yàn)，種子萌發(fā)采用培養(yǎng)皿濾紙卷法進(jìn)行。

試驗(yàn)一：將茖蔥干種子均勻排布于墊有2層無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿居中位置，CK的茖蔥種子經(jīng)去離子水浸泡12 h，濾紙及種子分別用PEG-8000 10%（t1）、20%（t2）、30%（t3）以及去離子水（CK、CK）始終保持濕潤(rùn)，將濾紙兩端卷起重疊使成卷狀。恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度設(shè)定為20 ℃，光照3 000 lx每天照明10 h。

試驗(yàn)二：層積后PEG-8000處理。層積處理以細(xì)沙為介質(zhì)，將細(xì)沙用清水反復(fù)洗凈，在105 ℃下消毒24 h后備用。干種子經(jīng)0.3% KMnO4溶液浸種消毒15 min，去離子水洗凈，種子與濕沙按1∶3的體積比混合，沙子濕度以手握成團(tuán)、松開(kāi)不散為宜[9]，裝入自封袋，置于4 ℃冰箱中冷藏。冷藏結(jié)束后，具體處理見(jiàn)表1，種子萌發(fā)方法同試驗(yàn)一的CK。每處理50粒種子，3次重復(fù)。

1.3 種子萌發(fā)的測(cè)定

種子萌發(fā)以胚根長(zhǎng)達(dá)2 mm為標(biāo)志。種子開(kāi)始萌發(fā)之日起，每5 d觀測(cè)并記錄種子的萌發(fā)狀況，將已萌發(fā)的種子及時(shí)取出，播種于已消毒的細(xì)沙作介質(zhì)的育苗盤(pán)。連續(xù)5 d無(wú)種子萌發(fā)則視為萌發(fā)結(jié)束。按李暢等[10]的方法計(jì)算發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間、發(fā)芽率（GR）、發(fā)芽指數(shù)（GI）、發(fā)芽勢(shì)（GE）等。

①發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間：指從萌發(fā)試驗(yàn)開(kāi)始到第1粒種子開(kāi)始萌發(fā)所持續(xù)的時(shí)間；

②發(fā)芽持續(xù)時(shí)間：種子開(kāi)始萌發(fā)到最后1粒種子萌發(fā)的總時(shí)間；

③發(fā)芽率（GR）/%=種子發(fā)芽總數(shù)/供試種子總數(shù)×100；

④發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（Gt·Dt-1），其中Gt為t日內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；

⑤發(fā)芽勢(shì)（GE）/%=種子發(fā)芽高峰時(shí)的發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100；

采用Excel 2003和DPS 7.05對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用最小顯著差數(shù)法（LSD）比較差異顯著性。

1.4 不定芽誘導(dǎo)材料處理

用自來(lái)水沖去茖蔥外植體上的灰塵和泥土，用軟毛刷配合洗潔精溶液刷洗外植體表面，除去附著在表面的部分菌體，然后用流水沖洗40 min[8]。在超凈工作臺(tái)上切取鱗莖，放入75%酒精中消毒30 s，然后轉(zhuǎn)入0.1% HgCl2溶液中消毒8 min，再用無(wú)菌水沖洗6次，用無(wú)菌濾紙吸干外植體上的水分，切除與消毒液接觸的傷口部位，并將幼嫩鱗莖切成0.5～0.8 cm小段，以備接種。

培養(yǎng)基的配制：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，0.7%的瓊脂，3%的蔗糖，pH調(diào)至5.8，添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，用不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（6-BA和2，4-D）處理，培養(yǎng)基配方見(jiàn)表4。

采用組培瓶培養(yǎng)，每瓶裝30 mL培養(yǎng)基，每瓶接種2塊，接種20瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)條件：溫度23 ℃、濕度65%；光照條件為：首先暗培養(yǎng)14 d，轉(zhuǎn)為光照2 500 lx，光期14 h/暗期10 h。調(diào)查不定芽開(kāi)始分化的時(shí)間，30 d后觀察并統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)數(shù)目及生長(zhǎng)情況。

不定芽分化率/%=不定芽誘導(dǎo)數(shù)/接種數(shù)（除去污染）×100。

參考唐銘[11]的研究結(jié)果，茖蔥誘導(dǎo)出不定芽30 d 后將不定芽繼代培養(yǎng)，60 d 后進(jìn)行增殖培養(yǎng)，將苗高約1.5 cm的健壯芽苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，最后完成茖蔥不定芽分化的再生體系。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)測(cè)定

2.1.1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG-8000對(duì)茖蔥種子發(fā)芽情況的影響 從表2可知，CK、t1、t2的發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間為50 d，CK和t3的發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間為60 d；CK和t3的發(fā)芽持續(xù)時(shí)間為20 d，t1、t2的發(fā)芽持續(xù)時(shí)間為25 d，CK持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)為30 d；發(fā)芽率t1最高為94.00%，t2與t1無(wú)顯著差異，CK與t2無(wú)顯著差異，CK最低為72.67%；發(fā)芽指數(shù)方面，t1最高為0.89，顯著高于t2和CK，t2和CK無(wú)顯著差異，CK和t3的發(fā)芽指數(shù)較低，且二者無(wú)顯著差異。由圖1可以看出，t2的發(fā)芽高峰期在56～65 d，其發(fā)芽勢(shì)為70.00%；61～70 d內(nèi)，t1的發(fā)芽勢(shì)最高為76.00%；t3和CK的發(fā)芽高峰期均在66～75 d內(nèi)，其發(fā)芽勢(shì)分別為72.00%和66.00%，同時(shí)此時(shí)間段內(nèi)t1的發(fā)芽勢(shì)仍然最高，為74.00%。

10%和20%的PEG-8000處理的茖蔥種子發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間早，發(fā)芽持續(xù)時(shí)間較短，發(fā)芽率高，而10%的PEG-8000處理發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均明顯高于20%的PEG-8000處理；去離子水浸泡12 h的茖蔥種子發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間早，但發(fā)芽持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)；CK和30%的PEG-8000處理的茖蔥種子發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間晚，發(fā)芽持續(xù)時(shí)間短，但發(fā)芽高峰期最晚，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)均較低。

2.1.2 層積及PEG-8000浸種對(duì)茖蔥種子發(fā)芽情況的影響 表3中T 5發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間最早，47 d即開(kāi)始萌發(fā)，同時(shí)發(fā)芽持續(xù)時(shí)間最短，僅63 d；CK開(kāi)始萌發(fā)的時(shí)間最長(zhǎng)為50 d；茖蔥種子發(fā)芽高峰期，除PCK和PT3外，其他處理均在47～55 d內(nèi)，此時(shí)間段內(nèi)的發(fā)芽勢(shì)PT5最高為92.00%，其次是PT4為80.00%，PT1、PT2、PT3無(wú)顯著差異，PCK最低為16.00%；PT5 的發(fā)芽數(shù)最多，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均最高，分別為96.00%和0.93，PT4與PT5無(wú)顯著差異，其次是PT3 、PT2和PT1，PCK發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均最低，分別為58.00%和0.48；PT1的爛種數(shù)最多，為6.67粒，PT5的爛種數(shù)最少，為1.67粒。

可見(jiàn)，茖蔥種子低溫層積50 d及PEG-8000浸種能顯著促進(jìn)茖蔥種子萌發(fā)，使發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間及發(fā)芽高峰期均提前，顯著提高了發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)，同時(shí)PEG-8000浸種能顯著減少種子層積后的爛種數(shù)。其中PT5 處理即種子沙藏層積后4℃冰箱保鮮50 d，再用200 mg·L-1 PEG-8000浸種4 h對(duì)促進(jìn)茖蔥種子發(fā)芽影響最大。

2.2 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)茖蔥不定芽誘導(dǎo)的影響

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在茖蔥直接分化再生體系的過(guò)程中至關(guān)重要，不定芽的產(chǎn)生與培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素（2，4-D）和細(xì)胞分裂素（6-BA）的比例有關(guān)，在二者配合使用的情況下，對(duì)茖蔥不定芽分化的影響存在較大差異。MS 培養(yǎng)基可使鱗莖直接誘導(dǎo)分化出不定芽，在培養(yǎng)15 d后開(kāi)始從切口邊緣長(zhǎng)出淺黃色的芽（圖2）。由表4可以看出，2，4-D質(zhì)量濃度較低時(shí)（1.0 mg·L-1），6-BA質(zhì)量濃度為1.5 mg·L-1時(shí)（ST2），芽的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)情況最優(yōu)，高于（ST1，2.0 mg·L-1）和低于（ST3，1.0 mg·L-1）此濃度都與其產(chǎn)生顯著差異；2，4-D質(zhì)量濃度較高時(shí)（2.0 mg·L-1），仍是6-BA質(zhì)量濃度為1.5 mg·L-1時(shí)（ST4）芽的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)情況顯著優(yōu)于1.0 mg·L-1（ST5）；但ST2和ST4除開(kāi)始分化時(shí)間無(wú)顯著差異外，ST2的不定芽分化率（56.56%）和莖芽高（3.86 mm）均顯著高于ST4，生長(zhǎng)情況也明顯優(yōu)于ST4?？梢?jiàn)，ST2的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，即MS+6-BA 1.5 mg·L-1 +2，4-D 1.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基配方不定芽分化快，叢生芽多，生長(zhǎng)狀況好，分化率高，最適合茖蔥不定芽的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。

表4 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)茖蔥不定芽誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響

[處理 ρ（生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑）/

（mg·L-1） 開(kāi)始分化

時(shí)間/d 不定芽分

化率/% 莖芽

高/mm 生長(zhǎng)情況 6-BA 2，4-D KT ST1 2.0 1.0 0.1 18.33 A 9.44 E 1.56 E 細(xì)弱（+） ST2 1.5 1.0 0.1 14.67 C 56.56 A 3.86 A 粗壯（++++） ST3 1.0 1.0 0.1 17.67 AB 33.78 C 2.00 C 中等（++） ST4 1.5 2.0 0.1 15.33 C 40.44 B 3.27 B 較粗壯（+++） ST5 1.0 2.0 0.1 18.00 A 18.89 D 1.86 D 細(xì)弱（+） ]

[注] 生長(zhǎng)情況以“+”表示，“+”越多表示長(zhǎng)勢(shì)越好。

3 討論與結(jié)論

茖蔥種子正常條件下發(fā)芽慢，所需時(shí)間長(zhǎng)，種子自然繁殖能力弱。王明焱等[12]研究認(rèn)為，茖蔥種子萌發(fā)受溫度因子影響較大，建議選擇20 ℃為發(fā)芽最適溫度。張忠寶等[6]的研究結(jié)果證明，茖蔥種子中存在抑制種子發(fā)芽的物質(zhì)，其抑制物不僅能抑制其他種子的發(fā)芽，也對(duì)其自身具有抑制作用，其抑制物可能是使茖蔥種子長(zhǎng)時(shí)間休眠的重要原因之一。宋發(fā)軍等[13]研究不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000和PEG-10000 對(duì)華重樓種子萌發(fā)的影響，其中25% PEG-4000 和25% PEG-8000浸種能有效打破華重樓種子休眠并促進(jìn)種子萌發(fā)。張忠寶等[14]的結(jié)果為低溫層積處理30～45 d和激素處理（GA3 100～150 mg·L-1、NAA 5 mg·L-1）浸種24 h均可顯著提高茖蔥種子發(fā)芽率。在筆者的研究中，前一年的茖蔥陳種子不經(jīng)過(guò)其他處理可以正常發(fā)芽，但發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間晚（60 d），持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)（80 d），發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)均較低，經(jīng)去離子水浸種12 h和PEG-8000處理均能促進(jìn)茖蔥種子萌發(fā)，浸種能使發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間提前，隨PEG-8000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，茖蔥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)有所降低，其中10%的PEG-8000處理可明顯促進(jìn)茖蔥種子發(fā)芽；茖蔥當(dāng)年新種子不進(jìn)行層積處理亦能發(fā)芽，但低溫層積50 d及PEG-8000浸種能顯著促進(jìn)茖蔥種子萌發(fā)，使發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間及發(fā)芽高峰期均提前，顯著提高了發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)，同時(shí)PEG-8000浸種能顯著減少種子層積后的爛種數(shù)。其中種子沙藏層積后4 ℃冰箱保鮮50 d，再用200 mg·L-1 PEG-8000浸種4 h對(duì)促進(jìn)茖蔥種子發(fā)芽的效果最好。2個(gè)發(fā)芽試驗(yàn)中，茖蔥種子發(fā)芽均較唐銘[11]、王明焱[12]、張忠寶等[13]的持續(xù)時(shí)間短，發(fā)芽高峰期提前。試驗(yàn)同時(shí)將已萌發(fā)的種子播種于細(xì)沙作介質(zhì)的育苗盤(pán)中育苗，所有種子均能正常出苗，且長(zhǎng)勢(shì)無(wú)差異。

茖蔥不定芽誘導(dǎo)是組培快繁過(guò)程中的最重要階段，筆者篩選出MS+6-BA 1.5 mg·L-1 + 2，4-D 1.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1為供試方案中的最優(yōu)培養(yǎng)基配方。與劉霞等[11]培養(yǎng)基成分為MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1（t1）適合不定芽誘導(dǎo)的試驗(yàn)結(jié)果略有不同，但理論是一致的，即芽生長(zhǎng)情況因6-BA和2，4-D的比值發(fā)生變化而變化，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度較低時(shí)，芽長(zhǎng)勢(shì)細(xì)弱纖小，隨著6-BA質(zhì)量濃度上升，長(zhǎng)勢(shì)變強(qiáng)，但到達(dá)一定質(zhì)量濃度后，長(zhǎng)勢(shì)逐漸變?nèi)酢１敬卧囼?yàn)優(yōu)化了茖蔥組織培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基配方，為后續(xù)不定芽增殖與生根奠定了基礎(chǔ)。

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