馬鈴薯瘡痂病菌（Streptomyces spp.）的鑒定

張建平，劉 佳，哈 斯，尹玉和，林團榮，胡 冰，張笑宇

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院植物保護研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.烏蘭察布市農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古 集寧 012000；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）分布在158個國家和地區(qū)，為世界上四大糧食作物之一，目前種植面積約1 920萬hm2。目前，中國馬鈴薯種植面積約564.5萬hm2，是世界第一生產(chǎn)大國[1]。由瘡痂鏈霉菌（Streptomyces spp.）引致的馬鈴薯瘡痂病為世界性病害，被視為馬鈴薯的第四大病害[2]。近年來，馬鈴薯瘡痂病在中國馬鈴薯產(chǎn)區(qū)逐年加重，特別是種薯田發(fā)生更嚴重[3]。馬鈴薯瘡痂病由不同的瘡痂鏈霉菌種引致，不同種的發(fā)病條件有差異[4]，鑒定明確瘡痂鏈霉菌種是馬鈴薯瘡痂病防治研究的基礎。

1 馬鈴薯瘡痂病病原菌

馬鈴薯瘡痂病病原菌為放線菌目（Actinomycetales）鏈霉菌科（Streptomycetaceae）鏈霉菌屬（Streptomyces）的一些種，稱馬鈴薯瘡痂鏈霉菌[3]，是世界上最早描述和鑒定的一個馬鈴薯瘡痂病病原菌種。

放線菌為形成分支絲狀體的革蘭氏陽性細菌，早先的分類系統(tǒng)將其分類為原核生物[5]。放線菌為單細胞結(jié)構(gòu)，又無定形的細胞核故與細菌性狀相似，但菌絲體的結(jié)構(gòu)和利用分生孢子繁殖又接近于真菌。因此，將放線菌看作是細菌和真菌間的過渡類群，近代植物分類將放線菌分在植物界細菌門[6]。目前，世界上描述的放線菌目已有6個科、30多個屬[3]。

鏈霉菌屬為放線菌目中的一個屬，好氣腐生，包括約800個種[3]。依據(jù)形態(tài)特征和培養(yǎng)形態(tài)主要劃分為14個類群，瘡痂病鏈霉菌歸屬第七類群，即燼灰類群。由于鏈霉菌能產(chǎn)生醫(yī)用抗菌素，如金霉素、氯霉素、新霉素、鏈霉素等，因此醫(yī)學上人們給予了更多研究[3]。能引起植物病害的并不多，其中鏈霉菌屬（Streptomyces）的一些種和近似的甘薯鏈霉菌（S.ipoimoea）可以引起植物病害[7]。20世紀90年代以前，國外主要報道的馬鈴薯瘡痂鏈霉菌種是S.scabies、S.acidiscabies和S.turgidiscabies[4]。

早期鏈霉菌屬種的鑒定主要根據(jù)形態(tài)和培養(yǎng)特征上的一些微小差異來建立新種，因為沒有統(tǒng)一的標準，容易導致混亂。1964年由國際微生物學會進行了統(tǒng)一鏈霉菌菌株和鑒定方法的工作，為此后的鑒定確定了模式菌株和統(tǒng)一標準[8]，也為第8版《伯杰細菌鑒定手冊》提供了大量數(shù)據(jù)[9]。

20世紀80年代中期以前，鏈霉菌種的鑒定主要以形態(tài)、培養(yǎng)特征、生理生化以及對馬鈴薯的致病性來進行。形態(tài)特征如孢子絲的形狀和排列方式、孢子表面結(jié)構(gòu)、單個菌落形態(tài)，氣生菌絲體、孢子堆顏色、基內(nèi)菌絲體顏色和可溶性色素的有無。生理生化特性如在復雜蛋白質(zhì)培養(yǎng)基內(nèi)是否產(chǎn)生黑色素、對于各種碳源的利用，蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶活性和是否產(chǎn)生硫化氫。另外，還應說明鏈霉菌的生態(tài)條件、如從什么環(huán)境里分離出來，腐生還是寄生，對于濕度和酸堿度的要求。如果是抗生素篩選，還應當描述其對微生物的拮抗性[3,4]。

馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌所在的燼灰類群的主要特征是氣絲灰色，基絲基本無色，孢子絲直、波曲或螺旋形，孢子圓、橢圓、柱形，孢子表面帶疣、刺、毛等[3]。

20世紀80年代中期以后，鏈霉菌的鑒定方法除了上述特征外，也借助于現(xiàn)代分子生物學的方法，如16S rRNA序列測定、脂肪酸、蛋白表達特征、DNA的G+C的moL百分含量、DNA的同源性和DNA-RNA雜交等，特別是16S rRNA序列測定由于其準確性和可靠性，使分類、鑒定和親緣關系的研究獲得了很好的結(jié)果[4,10]。

2 國外馬鈴薯瘡痂病病原菌鑒定

世界上首次報道馬鈴薯瘡痂病菌是Thaxter[11]，1892年他在美國康涅狄格州農(nóng)業(yè)試驗站的報告中對馬鈴薯瘡痂病原菌進行了描述，并將其命名為Oospora scabies。在隨后的研究中Gussow[12]確定該菌不是真菌，而是一種放線細菌，并將該菌名改為Actinomyces scabies。隨著1843年好氣腐生菌鏈霉菌屬的建立，瘡痂病菌歸屬為鏈霉菌屬，故Reynolds等[13]將其更名為Streptomyce scabies。S.scabies是最早被發(fā)現(xiàn)并廣泛分布的一個種，其主要特征是孢子灰色、光滑，孢子鏈螺旋彎曲，產(chǎn)生黑色素，在高于pH 5.0條件下生長。中國科學院微生物所放線菌分類組在《鏈霉菌鑒定手冊》中提到，1926年Millard和Burr從馬鈴薯瘡痂病斑上分離和描述了肉色鏈霉菌S.carnosus、纖細鏈霉菌S.gracilis、鑲邊鏈霉菌S.fimbriatus和威德摩爾鏈霉菌S.wedmorensis4個種[3]。1953年在美國的緬因州首次報道了一種在pH＜4.5的土壤中引起馬鈴薯瘡痂病的菌株，此后1968年Bonde和Mclntyre[14]、1977年Manzer等[15]以及1989年Lambert和Loria[16]的工作成功的分離到一種在pH＜4.5的土壤中引起馬鈴薯瘡痂病的菌株并明確了其基本特征，孢子為白色或者為橙紅色，孢子鏈呈直-柔曲狀，不能產(chǎn)生黑色素但可以產(chǎn)生可溶性色素，不能利用棉子糖作為碳源等，并且產(chǎn)生的癥狀與S.scabies產(chǎn)生的癥狀不容易區(qū)分開，由此鑒定為Streptomyces acidiscabies，也稱為酸性瘡痂。1981年Archuleta和Easton[17]從采自美國俄勒岡州一些縣的馬鈴薯凹陷瘡痂病斑分離獲得了 S.atroolivaceous，S.cinerochromogenes，S.corchorusii， S.diastatochromogenes， S.lydicus，S.malachiticus和3個未鑒定的種。1992年Christiane等[18]鑒定了以色列的菌株，結(jié)果為S.violaceus、S.gnseus、S.exfoliatus和 S.rochei 4個種。1993和1995年Faucher等[19,20]對采自加拿大魁北克省馬鈴薯塊莖凹陷病斑的菌株鑒定為S.aureofaciens、S.albidoflavus、S.scabies和 S.acidiscubie。1995 年Lorang等[21]將來自美國明尼蘇達州的菌株鑒定為S.scabies、S.albogriseolus和S.disstatochromogenes。1996年Goyer等[22]在加拿大從馬鈴薯凹陷瘡痂病斑分離到一株致病的鏈霉菌株，鑒定為S.caviscabies，該菌株與S.scabies和S.acidiscabies在形態(tài)、生理上有明顯不同。1998年Miyajima等[23]通過形態(tài)特征和16S rDNA序列分析鑒定了日本北海道菌株，其結(jié)果為一個新的種S.turgidiscabies，該新種明顯有別于其他鏈霉菌的種。

上述S.scabies、S.acidiscabies和S.turgidiscabies是國外20世紀90年代中期以前報道的主要種。除此之外，自20世紀90年代中期以來許多國家的學者結(jié)合形態(tài)、生理生化、分子生物學方法對馬鈴薯瘡痂病菌種的鑒定進行了大量研究，鑒定出了許多新的種[24-49]，如美國、日本、芬蘭、英國、挪威、法國、德國、韓國、瑞士、荷蘭、南非、西班牙、阿根廷、埃及等鑒定出了S.europaeiscabiei， S.stelliscabiei， S.reticuliscabiei，S.luridiscabiei，S.puniciscabiei等。由于國外這方面的研究很多，這里就不一一敘述，現(xiàn)將20世紀90年代中期以來鑒定的馬鈴薯瘡痂病原菌主要種歸納列入表1。隨著越來越多的種的鑒定，一方面表明了馬鈴薯瘡痂病病原菌種的多樣性，同時也給種的鑒定提出了更多的挑戰(zhàn)。

3 國內(nèi)馬鈴薯瘡痂病病原菌鑒定

中國對馬鈴薯瘡痂病的報道最早見于1999年[50]，有關馬鈴薯瘡痂病菌鑒定始見于2004年[51]。趙偉全等[52]對采自中國10個省（區(qū)）馬鈴薯瘡痂病菌菌株的生物學特性和16S rDNA序列進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)至少有3個種，分別為S.scabies、S.acidiscabies和一個未確定的種，結(jié)果也顯示來自黑龍江和四川的菌株主要是S.scabies，來自山東的菌株主要是S.acidiscabies，來自河北、山西、內(nèi)蒙古的菌株主要是一個新發(fā)現(xiàn)的種。2009年張萌等[53]利用16S rDNA序列對來自中國8個?。▍^(qū)）的34株馬鈴薯瘡痂病菌和15株參比菌株進行系統(tǒng)發(fā)育研究，發(fā)現(xiàn)中國的馬鈴薯瘡痂病菌有S.scabies、S.galilaeus、S.bobili、S.turgidiscabies、S.acidiscabies、S.setonii、S.diastatochromogenes、S.enissocaesilis，其 中 S.galilaeus、S.bobili、S.enissocaesilis為新種。2010年張萌等[54]基于河北、內(nèi)蒙古、四川、山東、陜西、山西、黑龍江、甘肅的30株馬鈴薯瘡痂病菌的生物學特性測試指標的聚類分析，發(fā)現(xiàn)病原菌主要由S.scabies、S.galilaeus、S.bobili等組成，與前期結(jié)果比較后發(fā)現(xiàn)，二者有一定差異，說明這些種仍然需要進一步鑒定明確。2008年杜娟等[55]對來自新疆伊犁地區(qū)具有瘡痂癥狀的薯塊進行了病原菌鑒定。經(jīng)形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生理生化的測定和16S rDNA序列分析，結(jié)果為S.acidiscabies和S.scabies，其中S.acidiscabies是優(yōu)勢種。2013年康蓉和王生榮[56]對2011～2012年采自甘肅武威市古浪縣，白銀市靖遠縣等病害嚴重發(fā)生地區(qū)馬鈴薯瘡痂病病原菌進行了分離鑒定。采用盆栽方法進行致病性測定、形態(tài)特征、生理生化特性測定和16S rDNA序列分析。結(jié)果確認引起甘肅馬鈴薯瘡痂病的病原菌有S.scabies和S.griseus，其中S.scabies為優(yōu)勢種。2014年張海穎等[57]為確定河北省張北地區(qū)馬鈴薯瘡痂病的病原，從該地區(qū)瘡痂病薯病斑上分離并經(jīng)溫室盆栽接種，確定了6株病原菌菌株，結(jié)合菌株生物學特性和16S rDNA序列特征進行鑒定，結(jié)果表明該地區(qū)的瘡痂病原菌比較復雜，但至少有S.scabies、S.europaeiscabiei和S.diastatochromogenes 3個種。2015年王丹等[58]為明確山西晉城馬鈴薯瘡痂病原菌種類，對其菌株進行了致病性、形態(tài)學、生理生化特性和16S rDNA序列測定，結(jié)果鑒定為S.scabies。2016年邢瑩瑩等[59]對2012～2013年從黑龍江省克山縣、綏化市、哈爾濱市、杜爾伯特蒙古族自治縣采集具有瘡痂病斑的馬鈴薯塊莖分離純化病原菌，對其進行16S rRNA和致病性鑒定，共分離出74株菌株，鑒定出致病性菌株26株，其中S.scabies或S.europaeiscabiei 21株，S.turgidiscabies3株和S.acidiscabies2株。2016年杜魏甫[60]對云南昆明、曲靖、楚雄、普洱、臨滄、紅河等地多點采集具有典型瘡痂病病斑的馬鈴薯，分離得到鏈霉菌143株，結(jié)合形態(tài)學和16S rDNA分子方法鑒定出7種鏈霉菌，分別是S.anulatus、S.scabies、S.acidiscabies、 S.griseus、 S.europaeiscabiei、S.caviscabies和 S.enissocaesilis。其中，S.anulatus、S.caviscabis首次在國內(nèi)發(fā)現(xiàn)。通過致病性鑒定發(fā)現(xiàn)，該7種病原菌均能引起不同程度的瘡痂病癥狀。2017年楊夢平等[61]通過形態(tài)、生理生化、致病性和16S rDNA序列分析，將從云南省13個馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集分離到的67株致病菌鑒定為S.caviscabies，S.anulatus，S.scabies，S.turgidiscabies，S.acidiscabies， S.europaeiscabiei， S.luridiscabiei，S.enissocaesilis，S.griseus和 S.aureofaciens。其中S.enissocaesilis和S.anulatus為優(yōu)勢種群，S.caviscabies，S.anulatus和S.luridiscabiei為國內(nèi)首次報道。2017年王甄[62]通過對病原菌的純化分離和分子鑒定發(fā)現(xiàn)恩施地區(qū)馬鈴薯瘡痂病菌的致病種類主要是S.scabies，S.acidiscabies，S.turgidiscabies 3個種，其中危害面積比較廣的是S.scabies。為簡明清晰將上述結(jié)果歸納于表2。

表1 國外已報道的馬鈴薯瘡痂病菌種類Table 1 Reported species of Streptomyces causing potato scab from abroad

表2 國內(nèi)已報道的馬鈴薯瘡痂病菌種類Table 2 Reported species of Streptomyces causing potato scab in China

上述國內(nèi)馬鈴薯瘡痂病原菌種的鑒定研究基本明確了所采集樣本地區(qū)的瘡痂病原菌種類，同時也表明不同省份的瘡痂病原菌種類有所不同，說明其遺傳存在著明顯多樣性，也證實了馬鈴薯瘡痂病原菌分布的地域性差異。因此，需要明確當?shù)伛R鈴薯瘡痂病病原菌的種類、分布和優(yōu)勢種，才能有針對性地進行防治研究。還應該注意的是，樣本采集應覆蓋所有馬鈴薯種植區(qū)域，以便獲得所研究區(qū)域所有馬鈴薯瘡痂病的病原菌種類。