急性低溫脅迫對史氏鱘幼魚抗氧化和免疫指標的影響

管 敏，張厚本，王 龍，唐大明，張德志，姜 偉

(中國長江三峽集團公司中華鱘研究所，三峽工程魚類資源保護湖北省重點實驗室，湖北宜昌 443100)

史氏鱘 (Acipenserschrenckii) 俗稱七粒浮子，主要分布于黑龍江、烏蘇里江和松花江等地，因其生長速度快、抗逆性強、肉質(zhì)鮮美，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，逐漸發(fā)展成為我國鱘養(yǎng)殖的主要品種之一[1]。史氏鱘作為一種亞冷水性魚類，環(huán)境溫度是影響其正常生長和代謝的重要環(huán)境因子之一，其最適生長水溫為19～22 ℃[2]。在史氏鱘的養(yǎng)殖過程中，經(jīng)常出現(xiàn)因季節(jié)更替、氣候變化及人為因素的原因?qū)е滤疁爻霈F(xiàn)節(jié)律性或突發(fā)性的溫度驟變[3]，從而對其造成一定程度的低溫脅迫。低溫脅迫包括冷馴化和溫度驟變，前者是指水溫的緩慢降低(慢性低溫脅迫)，而后者則指水溫的驟降(急性低溫脅迫)[4]。研究表明，低溫脅迫可以對魚類的行為[5]、營養(yǎng)代謝[6]、血液指標[5]、抗氧化能力[7]、免疫[8]、生殖進程[9]、胚胎發(fā)育和仔魚發(fā)育[10]等產(chǎn)生影響。當?shù)蜏孛{迫的強度在魚體耐受范圍內(nèi)時，魚體會通過自我調(diào)節(jié)適應低溫環(huán)境;當?shù)蜏孛{迫的強度超出魚類承受能力時，魚體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)將發(fā)生不可逆的改變，最終導致死亡[11]。因此，研究急性低溫脅迫對史氏鱘抗氧化和免疫的影響，可為史氏鱘的人工養(yǎng)殖和運輸提供重要的理論指導，具有非常重要的實際意義。

目前，關于史氏鱘的研究主要集中在營養(yǎng)[12]、繁殖[1]、病害[13]等方面，而關于急性低溫脅迫對史氏鱘抗氧化防御系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的影響研究未見報道。本實驗通過研究急性低溫脅迫條件下史氏鱘幼魚抗氧化和免疫指標的變化情況，掌握水溫驟降對其代謝水平和生理狀況的影響，從而為深入研究史氏鱘幼魚應激反應及耐寒機理提供理論依據(jù)，也為優(yōu)化史氏鱘的養(yǎng)殖、運輸技術提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗魚為中國長江三峽集團公司中華鱘研究所2016年全人工繁殖所得的史氏鱘幼魚。隨機挑選規(guī)格一致、體質(zhì)健康史氏鱘幼魚162尾，體質(zhì)量為 (180±16)g，體長為(30.50±1.50)cm，并將其暫養(yǎng)于直徑4.0 m的養(yǎng)殖池中，暫養(yǎng)水溫為23 ℃，溶氧6.0～7.0 mg/L，pH 7.3～7.6，氨氮0.01 mg/L，亞硝氮為0.005 mg/L，每天飽食投喂1次，3 d后開始實驗，實驗開始前1 d停止投喂。

1.2 實驗設計

實驗在直徑4.0 m、水深0.8 m的實驗池中進行，實驗水溫設置3個溫度水平，分別為23、17和11 ℃，其中，23 ℃組為常溫對照組，每個溫度組設3個平行組，每個平行組18尾魚。具體方法為:使用循環(huán)水系統(tǒng)的制冷機將實驗池中的水溫由23.0 ℃降至設定溫度后，將實驗魚從水溫23℃的暫養(yǎng)池中分別直接轉(zhuǎn)至水溫為11、17和23 ℃的實驗池中，2 h后再轉(zhuǎn)回水溫23 ℃的暫養(yǎng)池中進行恢復，并于0、3、6、12、24、48 h時取樣，每個溫度組每次取樣9尾魚;23 ℃組作為對照組，雖然水溫沒有變化，但也要經(jīng)歷人為轉(zhuǎn)魚的操作過程，避免人工操作對實驗造成的誤差。實驗期間，連續(xù)充氣，每隔30 min校準調(diào)節(jié)一次溫度，維持溫差在±0.5 ℃。

1.3 樣品的采集處理及各項指標的測定

用120 mg/L的MS-222將實驗魚快速麻醉后解剖，取肝臟組織。用預冷的魚用生理鹽水將肝臟沖洗干凈，濾紙吸干水分后將其切成小塊，并置于2 mL離心管中，經(jīng)液氮快速冷凍后，置于-70 ℃保存待測。

抗氧化指標包括超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、谷胱甘肽(GSH)含量、丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)活性;免疫指標包括溶菌酶(LZM)活性和免疫球蛋白M(IgM)。以上指標的測定采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒，具體實驗方法參考其說明書。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)用SPSS16.0和Excel 2016軟件進行統(tǒng)計分析與作圖，利用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan’s多重比較檢驗低溫脅迫對各項指標影響的顯著性，差異的顯著性以P< 0.05為標準，結(jié)果以平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 急性低溫脅迫條件下史氏鱘幼魚的行為表現(xiàn)

當水溫由23 ℃驟降至17 ℃時，史氏鱘幼魚的應激反應強烈，呼吸頻率加快，四處亂竄，不斷撞擊池壁，10 min后游動逐漸變慢，30 min后大部分魚伏底不動;當水溫由23 ℃驟降至11 ℃時，史氏鱘幼魚應激反應更為強烈，甚至有魚跳出水面的現(xiàn)象，隨著時間的推移，魚體游動的速度迅速下降，15 min后伏底不動，低溫脅迫結(jié)束時，魚體吻端、腹部和肛門充血，但未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

2.2 急性低溫脅迫對史氏鱘幼魚抗氧化指標的影響

2.2.1 SOD活性

如圖1所示，17 ℃和11 ℃組SOD活性隨恢復時間延長均呈波浪式變化，但11 ℃組SOD活性趨勢變化的時間拐點明顯滯后于17 ℃組;在23 ℃組中，SOD活性隨著恢復時間的增加總體呈緩慢增加的趨勢，其中，0 h組與48 h組差異顯著。此外，在0 ～3 h時，SOD活性隨水溫驟降溫差的增大呈先升后降的趨勢，且17 ℃組與11 ℃、23 ℃組差異顯著。

圖1 急性低溫脅迫對史氏鱘幼魚SOD活性的影響Fig.1 Effect of acute temperature stress on the SOD activity of juvenile Amur sturgeon圖柱上方不同小寫字母表示同一時間段內(nèi)不同溫度組之間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一溫度組不同恢復時間差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.2.2 CAT活性

圖2顯示，各溫度組CAT活性的變化趨勢與SOD相似。在11 ℃組中，6 h的CAT活性最大，顯著高于3 h組和24 h組;17 ℃組中，CAT活性在24 h時達到最大值，且24 h組與0 h組、3 h組均差異顯著;23 ℃組中，0 h組、3 h組CAT活性均顯著低于24 h組和48 h組。此外，17 ℃組CAT活性在各個時間段均高于11 ℃組和23 ℃組，但在0～12 h中差異均不顯著。

圖2 急性低溫脅迫對史氏鱘幼魚CAT活性的影響Fig.2 Effect of acute temperature stress on the CAT activity of juvenile Amur sturgeon

2.2.3 GSH含量

結(jié)果顯示，各溫度組GSH含量隨恢復時間的增加均呈波浪式變化(圖3)。在17 ℃組中，GSH含量先下降后升高，于24 h達到最大值，隨后又顯著下降;23 ℃組GSH含量的變化趨勢與17 ℃組相同，但各時間點之間差異不顯著;11 ℃組中，GSH含量在0～12 h顯著增加，24 h時出現(xiàn)顯著下降，隨后升高。結(jié)果還顯示，在0 h時，11 ℃組GSH含量顯著低于17 ℃、23 ℃組；而在6 h時，11 ℃組顯著高于17 ℃、23 ℃組;其它時間段內(nèi)，各組之間差異不顯著。

圖3 急性低溫脅迫對史氏鱘幼魚GSH含量的影響Fig.3 Effect of acute temperature stress on the GSH content of juvenile Amur sturgeon

2.2.4 T-AOC活性

如圖4所示，各溫度組T-AOC活性隨時間的增加基本均呈先升后降的趨勢。23 ℃組T-AOC活性在24 h時達到最大值，各時間組間差異不顯著;17 ℃組中，24 h T-AOC活性顯著高于其它各時間點;11 ℃組中，T-AOC活性在12 h時達到最大值，顯著高于0、24和48 h。此外，11 ℃組T-AOC活性在3～48 h中顯著低于17 ℃組。

圖4 急性低溫脅迫對史氏鱘幼魚T-AOC活性的影響Fig.4 Effect of acute temperature stress on the T-AOC activity of juvenile Amur sturgeon

2.2.5 MDA含量

如圖5所示，17 ℃和11 ℃組MDA含量隨恢復時間延長均呈波浪式變化，其中，17 ℃組MDA含量趨勢變化的時間拐點為3、6和24 h，11 ℃組MDA含量趨勢變化的時間拐點明顯滯后于17 ℃組，分別為6 h和24 h;11 ℃組MDA含量在0、3和12 h均顯著高于17 ℃、23 ℃組;23 ℃組MDA含量在0～24 h呈緩慢增加的趨勢，48 h時出現(xiàn)顯著下降。

圖5 急性低溫脅迫對史氏鱘幼魚MDA含量的影響Fig.5 Effect of acute temperature stress on the MDA content of juvenile Amur sturgeon

2.3 急性低溫脅迫對史氏鱘幼魚免疫能力的影響

2.3.1 LZM活性

如圖6所示，23 ℃組LZM活性隨著恢復時間的延長呈緩慢增加的趨勢，48 h顯著高于0 h;17 ℃組LZM活性隨恢復時間增加呈波浪式變化，其趨勢變化的時間拐點為3、6和24 h;11 ℃組LZM活性隨恢復時間的變化趨勢與17 ℃組基本相同，但趨勢變化的時間拐點(3 h和24 h)明顯滯后于17 ℃;此外，在0、3和6 h時，17 ℃時LZM活性均顯著高于11 ℃組。

圖6 急性低溫脅迫對史氏鱘幼魚LZM活性的影響Fig.6 Effect of acute temperature stress on the LZM activity of juvenile Amur sturgeon

2.3.2 IgM含量

在11、17 ℃組中，IgM含量隨恢復時間增加均呈先下降后升高的趨勢(圖7);在23 ℃組中，IgM含量隨著時間的延長呈緩慢增加的趨勢。在各個時間段內(nèi)，3個溫度組中IgM含量由大到小依次均為23 ℃組、17 ℃組和11 ℃組。

圖7 急性低溫脅迫對史氏鱘幼魚IgM含量的影響Fig.7 Effect of acute temperature stress on the IgM content of juvenile Amur sturgeon

3 討論

3.1 急性低溫脅迫對史氏鱘幼魚抗氧化指標的影響

水溫與魚類的各項生理活動有著非常緊密的關聯(lián)，溫度的變化會對魚類的行為、抗氧化防御系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等均會產(chǎn)生一定的影響。本實驗結(jié)果表明水溫驟降不僅對史氏鱘幼魚的游泳、呼吸等行為均產(chǎn)生了一定程度的影響，還導致魚體個別部位發(fā)生充血現(xiàn)象，與田甜等[14]的研究結(jié)果相似，這說明溫度突變對魚體產(chǎn)生了較強的脅迫作用，打破了魚體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，導致自由基 (ROS)大量產(chǎn)生，進而對魚體造成一定程度的損傷[15]。

超氧化物歧化酶 (SOD) 和過氧化氫酶 (CAT) 是抗氧化防御體系中非常重要的功能酶[16]，可聯(lián)合清除ROS，其活性的下降標志著機體清除ROS的能力下降[17]。本研究中，11 ℃組SOD和CAT活性隨時間的變化趨勢與17 ℃組基本相同，但其趨勢變化的時間拐點明顯滯后于17 ℃組。這說明水溫驟降溫差越大，對史氏鱘SOD和CAT活性的影響越大，其恢復至正常狀態(tài)所需時間也更長。23 ℃組SOD和CAT活性隨時間的變化總體呈緩慢增加的趨勢，可能與實驗過程中實驗魚停食3 d對魚體造成了一定程度的短期饑餓脅迫有關，這可能也是11 ℃組和17 ℃組SOD和CAT活性在24 h或48 h又出現(xiàn)升高的原因。另外，急性低溫脅迫后恢復0～3 h時，史氏鱘幼魚SOD、CAT活性隨水溫驟降溫差的增大均呈先升后降的趨勢，這與謝明媚等[18]、強俊等[19]的研究結(jié)果相同。表明當水溫由23 ℃驟降至17 ℃時，魚體可以通過提高SOD和CAT活性來應對低溫應激反應對魚體的影響;但當水溫驟降溫差增至12 ℃時，魚體抗氧化酶活性受到顯著抑制，使得11 ℃組SOD活性顯著低于17 ℃組。

谷胱甘肽(GSH)是一種低分子自由基清除劑，是清除ROS非常重要的非酶抗氧化物質(zhì)[20]。本實驗條件下，各溫度組GSH含量隨恢復時間的增加均呈波浪式變化，在12～24 h達到最大值后逐漸下降。這說明，隨著機體恢復時間的增加，GSH消耗量逐漸減小;而12～24 h后，肝臟GSH含量受魚體短期饑餓的影響又出現(xiàn)波動。這與劉松巖[21]研究饑餓脅迫對中華鱘血清GSH含量影響的結(jié)果基本一致。此外，在0 h時，11 ℃組GSH含量顯著低于17 ℃組和23 ℃組，這說明驟降溫差越大，機體產(chǎn)生的ROS越多，GSH消耗量越大。這也與李大鵬等[22]研究水溫對中華鱘血清活性氧含量及抗氧化防御系統(tǒng)的影響時所得出的結(jié)論相同。

總抗氧化能力(T-AOC)的大小是衡量機體抗氧化系統(tǒng)功能的綜合性指標，它可以反映機體抗氧化防御系統(tǒng)應對外來脅迫的能力[23]。本研究中，低溫脅迫組T-AOC活性在0 h最低，隨著ROS不斷被清除，T-AOC活性開始不斷增加，這說明魚體針對低溫脅迫已開啟自我保護機制，通過消耗抗氧化物質(zhì)來抵抗氧化反應帶來的損傷;在12～24 h時，T-AOC活性出現(xiàn)下降，原因可能與短期饑餓脅迫對魚體的影響有關。此外，11 ℃組T-AOC活性在3～48 h均顯著低于17 ℃組，這說明12 ℃驟降溫差對魚體的總抗氧化能力產(chǎn)生了顯著抑制作用，從而導致11 ℃組T-AOC活性恢復速度顯著低于17 ℃組。

丙二醛(MDA)是ROS與脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應的產(chǎn)物，它能夠加劇細胞膜的損傷，可以反映組織細胞受ROS攻擊的程度，從而間接反映機體抗氧化能力的強弱[18]。結(jié)果表明，17 ℃組和11 ℃組MDA含量隨恢復時間增加呈波浪式變化，這是魚體抗氧化防御體系對抗應激反應的結(jié)果。結(jié)果還表明，11 ℃組MDA含量在0、3、6、12和48 h均高于17 ℃組和23 ℃組，且11 ℃組MDA含量隨時間的變化趨勢明顯滯后于17 ℃組。這說明水溫驟降溫差越大，對肝臟損傷程度越大，其恢復至正常狀態(tài)所需的時間越長。這與孫學亮等[24]的研究結(jié)果基本相同，但江東能等[25]研究表明以色列紅羅非魚(Oreochromissp.)血清中MDA含量隨脅迫溫度的降低而降低，原因可能是ROS的產(chǎn)生量隨魚體溫度的降低而下降。

3.2 急性低溫脅迫對史氏鱘幼魚免疫指標的影響

溶菌酶(LZM)是魚體非常重要的免疫因子，它可以破壞革蘭氏陽性菌細胞壁中的肽聚糖，從而瓦解細菌細胞[26]。Saurabh等[27]報道，魚體溶菌酶活性與水溫、鹽度、細菌等環(huán)境因子密切相關。石小濤[28]研究認為擁擠脅迫會降低史氏鱘稚魚的LZM活性，何杰等[29]也曾報道，在急性應激條件下，魚體血清中LZM活性會顯著增加，肝臟也會受到一定程度的損傷。本研究中，23 ℃組LZM活性受短期饑餓的影響出現(xiàn)緩慢增加的趨勢;17 ℃組LZM活性在0、3和6 h時均顯著高于11 ℃組，這說明12 ℃的水溫驟降幅度顯著降低了魚體溶菌酶活性，對機體的免疫功能產(chǎn)生了顯著的抑制作用。這與童燕[17]的研究結(jié)果類似，即隨著鹽度的增加，史氏鱘血清LZM活性先升后降。該結(jié)果也與Fevolden等[30]認為脅迫的強度和方法可以影響溶菌酶活性變化的觀點一致。

免疫球蛋白M(IgM)是魚體內(nèi)一種重要的免疫球蛋白[29]，主要分布在血液中，是機體受抗原刺激后最先產(chǎn)生的抗體，具有強大的抗感染作用，因此，IgM含量的多少是評價魚體免疫應答反應的一項重要指標[19]。本研究中，在各個時間段內(nèi)，三個溫度組IgM含量由大到小依次為23 ℃組、17 ℃組和11 ℃組，表明溫度的驟降抑制了魚體IgM的產(chǎn)生，會對魚體的免疫功能產(chǎn)生顯著的抑制作用。這與低溫脅迫對銀鯧 (Pampusargenteus)幼魚[19]、羅非魚(Oreochromismossambicus)[29]的血清IgM影響結(jié)果基本類似，說明溫度的驟降抑制了IgM的產(chǎn)生，降低了魚體的免疫力。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)急性低溫脅迫對史氏鱘幼魚抗氧化能力和免疫機能具有顯著的影響，隨著恢復時間的增加，魚體抗氧化能力和免疫機能不斷恢復，但11 ℃組的恢復速度要顯著慢于17 ℃組，說明12 ℃的驟降溫差顯著抑制了魚體的抗氧化防御能力和免疫機能，對魚體的機能產(chǎn)生了顯著的不利影響，且修復較為緩慢。因此，在史氏鱘的實際養(yǎng)殖及運輸過程中，應密切關注水溫的變化，盡量避免水溫驟變脅迫對魚體造成損傷。