辛伐他汀對糖尿病大鼠腎臟的保護作用及其可能機制*

宛 欣， 王 茜， 李凡璐， 吳亞俐， 劉 鑫， 陳還珍， 楊 靜， 崔香麗△

(1. 山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理系, 2. 山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院心血管內科， 3. 山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院內分泌科， 太原 030001)

糖尿病 (diabetes mellitus, DM) 是由于胰島素分泌不足和/或作用缺陷引起的以高血糖為主的代謝性疾病，也是導致終末期腎病 (end stage renal disease, ESRD) 的常見原因。研究發(fā)現(xiàn)，內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)在糖尿病腎臟損傷的病理生理過程中起著重要作用。高濃度葡萄糖、炎癥、缺氧、氧化應激可以誘導內質網(wǎng)應激和腎臟細胞凋亡，隨后導致腎臟損傷[1]。炎癥反應與內質網(wǎng)應激聯(lián)系密切，共同促進糖尿病腎臟損傷的進程。

辛伐他汀(simvastatin)為3-羥甲基戊二酸單酰輔酶A (3-hydroxy-3-methyl glutarylcoenzyme A, HMG-CoA)還原酶的抑制劑，在臨床上用于降低總膽固醇(total cholesterol, TC)的合成和低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)的水平，此外還具有抗炎、抗氧化和保護血管內皮的作用[2-3]，現(xiàn)已作為治療動脈粥樣硬化的常規(guī)藥物。在治療心血管疾病的過程中發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀對糖尿病低血糖引起的心肌損傷有一定的保護作用，這種作用與抑制氧化應激和炎癥反應有關[4]。本課題前期的實驗已經(jīng)證明，辛伐他汀對糖尿病引起的心臟功能損傷的保護作用與NF-κB信號通路有關[5]。本研究擬通過建立糖尿病大鼠模型，觀察辛伐他汀對糖尿病大鼠的腎臟損傷有無保護作用，并檢測內質網(wǎng)相關蛋白葡萄糖調節(jié)蛋白78 (glucose regulated protein 78, GRP78)、磷酸化肌醇需求激酶1α (phosphorylated inositol-requiring enzyme 1α, p-IRE1α)，炎癥核心蛋白核因子-Kappa B p65 (nuclear factor-kappa B p65, NF-κB p65)，以及炎癥因子單核細胞趨化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)的表達水平，以探討辛伐他汀保護糖尿病腎臟的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

SPF級雄性Sprague-Dawley (SD) 大鼠，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-(軍)2012-0004。鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ, Sigma)，辛伐他汀(杭州默沙東制藥公司)，無醇蘇木素染液(Jiancheng Biotech)，伊紅染液(Jiancheng Biotech)，GRP78兔多克隆抗體(Abcam)，p-IRE1α兔多克隆抗體(Abcam)，NF-κB p65兔單克隆抗體 (Cell Signaling)，MCP-1兔多克隆抗體 (Abcam)，β-actin鼠單克隆抗體 (Proteintech)，HRP標記羊抗兔IgG (Transgen-Biotech)，羊抗小鼠IgG(Cell Signaling)，免疫組化試劑盒SABC即用型(武漢博士德)，天青石藍B(Solarbio)，天狼星紅染液(Solarbio)，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物)。

1.2 動物模型制備

24只SD大鼠隨機分為正常對照(NC，n=8)組和糖尿病造模(n=16)組。糖尿病造模組大鼠采用55 mg/kg STZ(溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，pH4.5)單次腹腔注射，建立糖尿病大鼠模型；NC組大鼠腹腔注射相同劑量的檸檬酸緩沖液。72 h后從大鼠尾靜脈采血測血糖，連續(xù)三天，隨機血糖≥16.7 mmol/L(300 mg/dl)即表示糖尿病造模成功。糖尿病造模組大鼠隨機分為糖尿病(DM)組和糖尿病+辛伐他汀(DM+Sim)組。DM+Sim組給予辛伐他汀生理鹽水混懸液40 mg/kg灌胃，1次/日，連續(xù)4周；其余兩組給予等體積生理鹽水灌胃，1次/日，連續(xù)4周。4周后殺死大鼠，快速取出雙側腎臟，使用(4～6)℃生理鹽水沖洗，部分腎組織置于10%福爾馬林液中固定，其余腎組織立即置-80℃超低溫冰箱中保存待用。

1.3 HE染色

腎組織石蠟包埋后切5 μm片，依次將切片置于蘇木素和伊紅染液中染色，氨水返藍，脫水透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察各組大鼠腎臟組織形態(tài)學改變。

1.4 天狼星紅染色

腎組織石蠟包埋后切5 μm片，依次將切片置入天青石藍染液和苦味酸天狼星紅染液中染色，鹽酸酒精分化。脫水透明，中性樹膠封片。每張片子隨機取5個視野拍照，依據(jù)image Pro plus軟件分析統(tǒng)計紅色膠原區(qū)域面積的比值。

1.5 Western blot檢測GRP78、p-IRE1α和NF-κB p65的表達

取腎皮質組織約50 mg，用RIPA裂解緩沖液裂解蛋白，BCA法測定蛋白質總濃度。取含總蛋白50 μg的腎皮質組織勻漿液10 μl，SDS-PAGE后半干轉移至PVDF膜上；5%脫脂奶粉(0.25 g脫脂奶粉+ 5 ml TBST)封閉1.5 h，洗膜后分別加入羊抗兔GRP78多克隆抗體(1∶1 000)、羊抗兔p-IRE1α多克隆抗體(1∶1 000)，羊抗兔NF-κB p65單克隆抗體(1∶1 000)、羊抗小鼠β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4℃過夜后加入HRP標記羊抗兔IgG(1∶2 000)或羊抗小鼠IgG(1∶ 2 000)，37℃孵育1.5 h；ECL顯色，Bio-Rad Image Lab凝膠成像系統(tǒng)顯影，并對Western blot條帶進行定量分析，確定雜交條帶的吸光度值。

1.6 免疫組織化學

腎臟組織石蠟包埋后切5 μm片，常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鈉熱修復抗原，3%H2O2約50 μl消除內源性過氧化物酶。5%BSA封閉。一抗為羊抗兔NF-κB p65單克隆抗體(1∶800)和羊抗兔MCP-1多克隆抗體(1∶100)，二抗為生物素標記的羊抗兔IgG，以PBS替代一抗作為陰性對照，DAB顯微鏡下控制顯色，蘇木素復染。按著色范圍和著色強度計數(shù)結果的乘積作為評分結果[6]。

1.7 原位末端轉移酶 (TUNEL)法檢測腎臟細胞凋亡

腎臟組織石蠟切5 μm片，常規(guī)脫蠟至水，ProteinaseK工作液37℃消化，3%H2O2約50 μl消除內源性過氧化物酶，TDT酶反應液避光孵育，Streptavidin-HRP工作液避光反應，DAB顯色，蘇木素復染。凋亡細胞核呈棕褐色顆粒，每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)，計算該視野中陽性細胞所占的百分比。光鏡下觀察并計數(shù)凋亡細胞，腎臟細胞凋亡指數(shù) (apoptosis index, AI) =視野中腎臟陽性細胞數(shù)/視野中腎臟細胞總數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 大鼠腎臟組織病理學變化

HE染色切片置100倍光學顯微鏡下觀察，與NC組比較，DM組可見大量的腎小球硬化，部分腎小球變形、萎縮，結構不清，腎小管間質可見明顯的炎細胞浸潤以及纖維化；置400倍光學顯微鏡下觀察，可見DM組腎小球明顯硬化、固縮，血管腔和腎小球囊腔明顯狹窄，甚至閉塞，系膜細胞和系膜基質明顯增多，說明DM組大鼠腎臟組織明顯損傷，糖尿病腎病造模成功；而DM+Sim組腎組織結構較DM組明顯改善，NC組大鼠腎臟無明顯病理學改變(圖1，見彩圖頁Ⅰ)。

2.2 天狼星紅染色觀察腎臟組織間質纖維化

在普通顯微鏡下，NC組腎小球以及腎小管紅色的膠原纖維呈均勻分布，著色淺；DM組大鼠腎小球以及腎小管膠原纖維紅染明顯廣泛，著色深，纏繞混亂，呈不均勻分布(P<0.01)；與DM組比較，DM+Sim組較紅染明顯減輕(P<0.01)，說明糖尿病大鼠腎臟發(fā)生了明顯的炎癥纖維化，辛伐他汀能減輕糖尿病腎臟的間質纖維化(圖2，見彩圖頁Ⅰ)。

2.3 Western blot檢測GRP78、 p-IRE1α以及NF-κB p65蛋白質的表達

與NC組相比，DM組大鼠腎臟的GRP78、p-IRE1α以及NF-κB p65蛋白質表達均顯著升高 (P<0.05)。而給予辛伐他汀后，大鼠GRP78、p-IRE1α以及NF-κB p65蛋白質表達均比DM組降低(P<0.05，圖3)。提示辛伐他汀對糖尿病腎臟的保護作用可能與降低GRP78、p-IRE1α和NF-κB p65的表達有關。

Fig.3Expression of GRP78, p-IRE1α and NF-κB p65 in rat kidneys

**P<0.01vsNC group;#P<0.05vsDM group

2.4 免疫組織化學法檢測腎臟中NF-κB p65、MCP-1蛋白質的表達

NC組大鼠腎小球以及腎小管間質有極少量NF-κB p65表達；DM組大鼠腎小球內皮細胞、系膜細胞以及腎小管上皮細胞核明顯呈棕黃色，即NF-κB p65呈強陽性表達(P<0.01)；糖尿病大鼠給予辛伐他汀后，較DM組細胞核棕黃色染色明顯減少(P<0.05)。MCP-1表達于細胞質中，NC組腎小球系膜區(qū)和腎小管間質MCP-1表達極少，而DM組大鼠腎小球系膜區(qū)和腎小管間質著色廣泛、濃集，內皮細胞、系膜細胞，尤以腎小管上皮細胞MCP-1表達呈強陽性(P<0.01)；糖尿病大鼠給予辛伐他汀后，MCP-1表達明顯下降，其著色部位與糖尿病組大鼠大致相同，但著色程度低于DM組(P<0.01，圖4)。

Fig.4NF-κB p65 and MCP-1 expression in rat kidney detected by immunohistochemistry

**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsDM group

2.5 TUNEL法定位檢測腎組織細胞凋亡

腎臟細胞凋亡的原位檢測結果顯示，正常細胞核呈藍紫色；凋亡的細胞核呈棕褐色顆粒樣，部分凋亡的細胞核固縮變形，體積偏小。NC組僅見少量凋亡的細胞核，而DM組腎小球內及腎小管見有大量顆粒樣的的凋亡細胞核，明顯高于對照組(P<0.01)；給予辛伐他汀后，大鼠腎臟凋亡細胞核較DM組明顯減少(P<0.01，圖5)。

Fig.5TUNELresults of apoptosis in glomerular and renal tubular cell in rats

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsDM group

3 討論

糖尿病所致腎臟損傷是糖尿病微血管病變的主要并發(fā)癥之一。本實驗采用鏈脲佐菌素制造糖尿病大鼠模型觀察糖尿病造成的腎損傷，HE染色結果發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎小球明顯萎縮、變形，系膜細胞明顯增多；同時天狼星紅染色也觀察到糖尿病大鼠腎小球及腎小管膠原纖維明顯紅染，纏繞混亂呈結節(jié)狀。高血糖可促進腎小球高灌注和高濾過，刺激鈉葡萄糖轉運蛋白-2(SGLT-2)的表達，鈉和葡萄糖的重吸收增加激活了腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosteronesystem, RAAS)以及促進上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，過多的成纖維細胞滲入間質，導致間質纖維化[7]。此外高糖環(huán)境還可損傷腎臟固有細胞，細胞損傷后誘導單核/巨噬細胞和淋巴細胞的進行性間質內流，同時激活成纖維細胞分泌膠原纖維，積累在損傷部位，導致炎癥纖維化的產(chǎn)生[8]。本研究結果顯示，糖尿病大鼠給予辛伐他汀治療后，病理學形態(tài)改善明顯，同時膠原纖維明顯減少，證實辛伐他汀能夠保護糖尿病大鼠腎臟、減輕纖維化。

炎癥核心因子NF-κB p65和MCP-1在糖尿病大鼠腎臟組織中呈高表達，給予辛伐他汀后這些炎癥因子表達均降低。已有動物實驗表明，大鼠腎小球MCP-1等表達增加會導致炎癥的產(chǎn)生[9]和腎小球硬化[10]。Saitoh等[11]發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者尿液中MCP-1水平升高，且與腎臟損傷的嚴重程度呈正相關。而在糖尿病腎小管上皮細胞中，NF-κB的活性與MCP-1的表達高度相關，NF-κB的活化可以誘導單核巨噬細胞聚集，并通過激活MCP-1促進腎小管間質纖維化[12]。本結果也說明，炎癥反應參與了糖尿病大鼠腎臟損傷的發(fā)生發(fā)展，辛伐他汀能通過抑制糖尿病大鼠腎臟炎癥反應改善腎臟功能。

炎性因子以及高糖環(huán)境可以誘導ERS，使蛋白質折疊受阻，啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)[1]。原本與GRP78蛋白質結合并處于失活狀態(tài)的IRE1α與GRP78解離，并磷酸化生成p-IRE1α而被激活。過強或過長時間的ERS最終導致細胞發(fā)生炎癥反應及凋亡[13]。在內質網(wǎng)應激的未折疊蛋白反應(UPR)中，p-IRE1α進一步激活IKK成為p-IKK，促進IκB磷酸化后與NF-κB解離，游離的NF-κB亞基p65迅速進入細胞核，與特異性κB序列結合，誘導炎癥相關基因的轉錄，促進炎癥反應的發(fā)生[14]。NF-κB的核移位可促進MCP-1以及細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的表達，導致腎小球和腎小管間質炎細胞浸潤[15]。ERS中的UPR可以啟動炎癥反應，而炎性因子又可誘導內質網(wǎng)應激，產(chǎn)生一系列的炎癥反應，如此循環(huán)加劇組織損傷。本研究顯示，糖尿病大鼠腎臟組織GRP78和p-IRE1α表達均升高；辛伐他汀可抑制腎GRP78和p-IRE1α表達，表明糖尿病大鼠腎臟組織也發(fā)生了內質網(wǎng)應激。辛伐他汀可以有效抑制內質網(wǎng)應激，并通過抑制IRE1α磷酸化降低了炎癥核心蛋白NF-κB的核移位，有效抑制了腎臟組織MCP-1表達，減輕了腎臟組織炎癥和纖維化，從而改善了腎臟功能。

本研究還觀察到，糖尿病大鼠腎小球和腎小管中存在大量凋亡的細胞核。而給予辛伐他汀治療后，凋亡的細胞核明顯減少，與Ishii等[16]在糖尿病大鼠腎組織中發(fā)現(xiàn)大量凋亡的近端小管細胞的結果相似。在高糖環(huán)境下，過長的內質網(wǎng)應激可導致GRP78--procaspase-12--procaspase-7復合物裂解，釋放有活性的caspase-12，介導腎臟固有細胞凋亡[17]；此外，炎癥反應還可通過線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生超氧化物，阻礙電子傳遞復合物Ⅲ，擾亂促凋亡和抗凋亡蛋白質的穩(wěn)定，激活線粒體依賴凋亡途徑[18]。辛伐他汀可通過抑制細胞凋亡來保護腎臟，但具體通過哪條凋亡途徑發(fā)揮作用，有待進一步研究。

綜上所述，糖尿病可造成大鼠腎臟損傷，發(fā)生腎小球萎縮和腎纖維化，導致炎性因子p-IRE1α和NF-κB表達升高、內質網(wǎng)應激和腎細胞凋亡，內質網(wǎng)應激和炎癥反應又加劇糖尿病腎臟的損傷。辛伐他汀通過有效抑制炎癥反應和內質網(wǎng)應激，減少腎臟細胞凋亡來緩解糖尿病所致的腎臟損傷，既可以降低由糖代謝異常引起的脂質代謝紊亂，又可有效預防和治療糖尿病腎損傷，延緩病程。本實驗為糖尿病腎臟疾病的治療以及他汀類新藥的開發(fā)利用提供了理論基礎和實驗依據(jù)。