血漿miRNA-1、miRNA-21對冠心病合并糖尿病患者PCI術后支架內(nèi)再狹窄的影響*

關晶晶， 張 穎， 劉玉潔△

(1. 天津醫(yī)科大學研究生院， 天津 300070； 2. 天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)四科， 天津 300222)

冠脈支架內(nèi)再狹窄(in-stent restenosis，ISR)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)患者支架植入術后中遠期最主要的并發(fā)癥之一，也是當前經(jīng)皮冠狀動脈介入治療( percutaneous coronary intervention，PCI)領域亟待解決的問題。雖然目前大多使用藥物洗脫支架(drug-eluting stent，DES)，ISR發(fā)生率較金屬裸支架明顯減低，但其發(fā)生率仍在5%～10%[1]。評價ISR的金標準仍然是冠狀動脈造影(coronary arteriongraphy，CAG)檢查，但其存在有創(chuàng)性及一定的并發(fā)癥。因此，尋找可以預測支架植入患者預后，甚至診斷ISR的生化標志物具有重要臨床意義。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類由約22個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，通過識別靶基因3’端非編碼區(qū)靶位點，引起靶基因mRNA降解或抑制其翻譯，進而廣泛地負調(diào)控靶基因表達[2]。研究表明，miRNA在心血管細胞的生長發(fā)育、增殖遷移、損傷凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[3]。隨著胰島素及各種降糖藥的廣泛應用，糖尿病(diabetes mellitus，DM)合并酮癥酸中毒及感染致死率明顯下降，心血管病已成為威脅DM患者生命最嚴重的疾病。Maeng等報道，合并DM的CHD患者PCI術后9個月支架內(nèi)再狹窄率遠高于非合并DM的CHD患者，同時DM組具有更多的靶血管重建[4]。Jeff等研究表明，miRNA與DM血管缺血/再灌注損傷及血管新生密切相關，在血管內(nèi)皮修復中起負調(diào)節(jié)作用[5]。

近年來，大量研究表明miRNA-1、miRNA-21與心血管疾病密切相關。研究顯示，miRNA-1在心肌肥大、心肌梗塞、心律失常等心臟病中發(fā)揮重要作用[6]，miRNA-21可促進損傷后新生內(nèi)膜增生，減少梗死面積[7]。現(xiàn)階段，miRNA-1、miRNA-21與CHD(尤其是CHD合并DM)患者PCI術后再狹窄相關性的試驗研究較少見，且由于存在各類混雜因素，其結論尚不明確。本研究旨在分析對照組及CHD組患者血漿中miRNA-1、miRNA-21的含量差異，以及miRNA-1、miRNA-21對CHD合并DM患者的影響，并分析支架置入術后ISR患者與NISR患者血漿miRNA-1、miRNA-21含量的差異，進一步探討miRNA-1、miRNA-21預測CHD患者，尤其是對CHD合并DM患者發(fā)生ISR的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

連續(xù)入選2013年12月～2015年12月來自天津市胸科醫(yī)院行CAG檢查的382例患者(n=382)，將其分為對照組和CHD組。對照組為可疑心絞痛行CAG檢查排除CHD的患者，共195例(n=195)，根據(jù)是否患DM，又將對照組分為正常對照組(n=150)和單純DM組(n=45)。CHD組為既往已行PCI治療并復查CAG的患者，共187例(n=187)，根據(jù)是否合并DM，又將CHD組分為單純CHD組(n=119)及CHD合并DM組(n=68)；根據(jù)復查CAG結果，又將CHD組(n=187)分為ISR組(n=48)及NISR組(n=139)，又根據(jù)是否合并DM，將ISR組分為單純ISR組(n=26)及ISR合并DM組(n=22)。

診斷標準 ⑴CHD：CAG證實至少有1支冠脈分支血管直徑狹窄<50%。⑵ISR[8]：CAG證實支架部位管腔狹窄≥50%(包括支架兩端5 mm以內(nèi))，且排除支架內(nèi)血栓和支架斷裂。⑶DM：患者有糖尿病癥狀+隨機血糖≥11.1 mmol/L，或空腹血糖(指至少空腹8 h)≥7.0 mmol/L，或葡萄糖負荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L。

納入標準：⑴NISR組均為CAG檢查證實支架內(nèi)通暢患者(支架內(nèi)管腔狹窄為0)；⑵入選患者植入的支架均為DES；⑶ISR組患者均為首診、單處病變，且在PCI術后1～2年內(nèi)的患者。

排除標準：⑴2處及2處以上的ISR患者；⑵急性心肌梗死合并支架內(nèi)血栓或支架斷裂的患者；⑶合并心臟瓣膜病、嚴重心力衰竭、嚴重心律失常、嚴重肝腎功能不全、嚴重呼吸系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病及既往接受心臟外科手術治療的患者。

1.2 主要試劑及儀器

總RNA提取試劑盒、RNA反轉錄試劑盒、熒光實時定量PCR (qRT-PCR) 試劑盒、成熟miRNA序列(ID000200)、miRNA-21序列(ID000397)、miRNA-1序列(ID000416)、熒光探針及外源性cel-miRNA-39、無水乙醇、無RAN酶純水均購自美國ABI。7500型定量PCR儀(美國ABI)、低溫高速離心機(Sigma)。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本收集 入選對象均于空腹狀態(tài)抽取外周靜脈血4 ml，置入枸櫞酸鈉抗凝管中，4℃、3 000 r/min離心10 min，吸取上清液于-80℃保存。

1.3.2 樣本處理 提取總RNA，反轉錄后運用試劑盒qRT-PCR進行定量檢測，95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、60 s，40個循環(huán)，組內(nèi)重復3次取平均值。miRNA表達水平以Ct值表示，采用2-△△Ct法比較miRNA的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 CHD組miRNA-1、miRNA-21表達水平的變化

結果顯示：與對照組相比，CHD組miRNA-1、miRNA-21含量均升高(P<0.05，表1)。

GroupnmiRNA-1miRNA-21Control group1950.452±0.1430.469±0.213CHD group1870.507±0.177*0.509±0.165*

CHD: Coronary atherosclerotic heart disease

*P<0.05vscontrol group

2.2 CHD合并DM組miRNA-1、miRNA-21表達水平的變化

根據(jù)是否患DM，進一步細分各組(表2)。結果顯示：與正常對照組相比，單純DM組miRNA-21含量減低(P<0.05)，而miRNA-1含量無明顯變化(P<0.05)；與單純CHD組相比，CHD-DM組miRNA-1、miRNA-21含量均增加(P<0.05)。

GroupnmiRNA-1miRNA-21Normal group1500.458±0.1420.513±0.203Simple-DM group450.432±0.1450.321±0.179*Simple-CHD group1190.492±0.1690.488±0.145CHD-DM group680.533±0.189#0.547±0.190#

Simple-DM: Simple diabetes mellitus; Simple-CHD: Simple coronary atherosclerotic heart disease; CHD-DM: Coronary atherosclerotic heart disease combined with diabetes mellitus

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vssimple-CHD group

2.3 ISR組與NISR組miRNA-1、miRNA-21表達水平的比較

結果顯示：與NISR組相比，ISR組miRNA-1、miRNA-21含量均明顯升高(P<0.05，表3)。根據(jù)是否合并DM，進一步細分ISR組。結果顯示：與單純ISR組比較，ISR-DM組miRNA-21含量明顯升高(P<0.05)，而miRNA-1含量則無明顯差異(P<0.05，表4)。

GroupnmiRNA-1miRNA-21NISR group1390.489±0.1740.440±0.101ISR group480.559±0.178*0.711±0.148*

NISR： Non-in-stent restenosis； ISR: In-stent restenosis

*P<0.05vsNISR group

GroupnmiRNA-1miRNA-21Simple-ISR group260.544±0.1460.665±0.153ISR-DM group220.576±0.2130.768±0.119*

Simple-ISR: Simple in-stent restenosis; ISR-DM: In-stent restenosis with diabetes mellitus

*P<0.05vssimple-ISR group

2.4 CHD合并DM患者PCI術后再狹窄危險因素分析

以CHD為因變量，DM病史、miRNA-1、miRNA-21為自變量進行單因素logistic回歸分析，并將有統(tǒng)計學意義的變量進行多因素回歸分析。結果顯示：DM、miRNA-1、miRNA-21是CHD的獨立危險因素(OR=2.123；OR=3.066；OR=1.924，P<0.05，P<0.01，表5、6)。

以ISR為因變量，DM病史、miRNA-1、miRNA-21為自變量進行單因素logistic回歸分析，并將有意義統(tǒng)計量進行多因素回歸分析。結果顯示：DM病史、miRNA-21是發(fā)生ISR的獨立危險因素(OR=3.091，OR=5.654；P<0.05，P<0.01，表5、6)；同時，在CHD-DM組中，以ISR為因變量，以miRNA-1、miRNA-21為自變量進行單因素logistic回歸分析，結果顯示：miRNA-21是CHD合并DM患者PCI術后再狹窄的獨立危險因素(OR=9.148，P<0.01，表7)。采用ROC曲線評價miRNA-1、miRNA-21對CHD患者及CHD合并DM患者發(fā)生ISR的預測價值。結果顯示：miRNA-1、miRNA-21表達量對CHD患者發(fā)生ISR有較高診斷價值(AUC=0.854，95%CI為0.801-0.907；AUC=0.857，95%CI為0.768-0.947，圖1A、圖1B)；對于CHD合并DM患者，miRNA-21有較高診斷價值(AUC=0.783，95%CI為0.631-0.935，圖2A)，而miRNA-1的診斷價值較低(AUC=0.463，95%CI為0.294-0.632，圖2B)。

Tab.5Single regression analysis of CHD, ISR

IndexβWaldχ2POR95%CIDM1.02019.4600.001*2.7731.762-4.362CHDmiRNA-11.30558.1390.001*3.6892.637-5.159miRNA-210.72031.3300.001*2.0541.596-2.643DM1.39715.4620.001*4.0432.015-8.113ISRmiRNA-10.5386.4230.001*1.7131.101-4.966miRNA-211.84541.0320.001*6.3273.598-11.125

*P<0.05

Tab.6Multiple regression analysis of CHD, ISR

IndexβWaldχ2POR95%CIDM0.7534.9020.0272.1231.090-4.135CHDmiRNA-11.12033.6020.001*3.0662.099-4.478miRNA-210.6559.5620.0021.9241.271-2.914DM1.1294.6170.0323.0911.104-8.653ISRmiRNA-10.0680.2170.6411.0700.850-1.421miRNA-211.73228.6400.001*5.6542.998-10.662

*P<0.05

Tab.7Single regression analysis of ISR in CHD-DM group

IndexβWaldχ2POR95%CImiRNA-10.1707.7130.1911.1800.919-1.529miRNA-214.5169.2870.002*9.1485.010-16.703

*P<0.05

Fig.1The ROC curve of CHD group

A： miRNA-1; B： miRNA-21

Fig.2The ROC curve of CHD-DM group

A： miRNA-1; B： miRNA-21

3 討論

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一組從內(nèi)膜開始，先后在局部發(fā)生脂質(zhì)與復合糖類積聚、纖維組織增生和鈣質(zhì)沉積形成斑塊，并伴有血管壁中層退變，繼發(fā)斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂及局部血栓形成的病變。Zhu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，血漿中miRNA-1可作用于靶基因肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)，上調(diào)MLCK表達，促使細胞向心性收縮，增加血管內(nèi)皮通透性，使炎性細胞、脂質(zhì)成分等易于侵入并沉積于血管內(nèi)皮內(nèi)，進而發(fā)生AS。Xu等[10]將體外合成的miRNA-1導入心肌細胞，發(fā)現(xiàn)miRNA-1過度表達可增高心肌細胞半胱氨酸天冬氨酸酶-3(caspa細-細胞等上呈高表達，并在許多心血管疾病中呈差異性表達[11]。Jansen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，缺血預適應可顯著上調(diào)miRNA-21表達，并通過下調(diào)其靶基因程序性細胞死亡因子-4(programmed cell death 4，PDCD4)，抑制PDCD4下游的轉錄因子活化蛋白質(zhì)-1(activated protein-1，AP-1)激活，對抗氧化應激損傷和細胞凋亡。本研究檢測外周血血漿miRNA-1、miRNA-21含量發(fā)現(xiàn)，CHD組患者血漿miRNA-1、miRNA-21含量均顯著高于對照組。結合上述研究，我們推測，miRNA-1表達增加可促進心肌缺血/再灌注損傷，而機體可通過增加miRNA-21表達保護缺血/再灌注損傷的心肌。

美國糖尿病學會(American Diabetes Association，ADA)和心臟病學會(American Heart Association，AHA)認為，DM是CHD的獨立致病因素。Erkan等[13]采用冠狀動脈Gensini評分系統(tǒng)評估冠脈病變的嚴重程度和范圍，結果顯示CHD合并DM患者的評分明顯高于非合并DM的CHD患者，其三支冠脈分支的病變率、彌漫性病變率、病死率均高，且預后差。李雯琦等[14]發(fā)現(xiàn)，DM大鼠心肌組織中miRNA-1含量明顯低于正常對照組，與高糖誘導心肌細胞肥大相關指標呈現(xiàn)同步性變化，且與ANP基因表達水平呈線性相關。劉顯慶等[15]觀察了在不同濃度葡萄糖中培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞miRNA-21和 PDCD4 的表達情況，發(fā)現(xiàn)高糖可下調(diào)血管內(nèi)皮細胞中miRNA-21表達，同時增加PDCD4蛋白質(zhì)表達，增加心肌或血管平滑肌細胞中氧化應激損傷和細胞凋亡。上述研究均表明，miRNA-1、miRNA-21與DM患者的心血管并發(fā)癥密切相關。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，單純DM組患者血漿miRNA-21含量減低，而單純DM組與CHD-DM組miRNA-1含量無明顯差異，可能與我們檢測的是外周血血漿相關。

ISR的發(fā)生是個復雜的病理生理過程，確切機制尚不明確，但歸納起來主要包括內(nèi)皮損傷、血栓形成、內(nèi)膜增生和血管重構。基于上述miRNA-1、miRNA-21與CHD關系的研究，我們推測miRNA-1、miRNA-21在ISR中也可能起重要作用。本研究通過對ISR組與NISR組血漿miRNA-1、miRNA-21含量的比較，證實了上述推測，ISR組miRNA-1和miRNA-21含量明顯高于NISR組。

miRNA-1參與ISR發(fā)生的機制可能與誘導心臟成纖維細胞向心肌樣細胞轉分化及作用于靶基因介導平滑肌細胞分化、增值等有關。張成等[16]發(fā)現(xiàn)，將miRNA-1轉染到心臟成纖維細胞，心肌細胞特異性因子Gata4、Tbx5、Mef-2c表達明顯增高，證實miRNA-1可誘導心臟成纖維細胞向心肌樣細胞轉分化。此外，miRNA-1還可通過靶基因組蛋白去乙?；?HDAC4)介導平滑肌細胞(VSMC)分化及增殖[17]，而心臟成纖維細胞過度轉分化及VSMC過度增殖均可引起血管壁增厚、管腔狹窄，最終導致ISR發(fā)生。但剌梅等[18]通過比較PCI術后兩組患者血漿miRNA-1含量，發(fā)現(xiàn)：與NISR組比較，ISR組miRNA-1含量降低，與本研究結果不一致。同時，本研究中合并DM與非合并DM的ISR患者，其miRNA-1含量無明顯差異，而Feng等[19]研究發(fā)現(xiàn)，DM動物通過抑制miRNA-1增加內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)表達，誘發(fā)心肌細胞糖超載及內(nèi)皮功能紊亂，最終導致ISR發(fā)生，研究結果的差異可能與本研究ISR樣本量較小有關。因此，還需要更大量樣本的研究來探討miRNA-1對CHD(尤其是CHD合并DM)患者發(fā)生ISR的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，單純DM患者miRNA-21表達量下降，而合并DM的CHD及合并DM的ISR患者血漿miRNA-21含量增加，我們推測miRNA-21對血管內(nèi)皮細胞具有雙重作用，一方面，miRNA-21表達增加可通過PTEN/PI3K-AKT信號轉導途徑抗細胞凋亡[12]，而miRNA-21表達減低可增加PDCD4蛋白表達，增加心肌或血管平滑肌細胞中氧化應激損傷和細胞凋亡[15]；另一方面，miRNA-21通過介導內(nèi)皮細胞損傷、增殖及促進VSMC增殖等機制，參與血管壁新生內(nèi)膜形成，最終導致ISR。Ji等[20]的研究證實了這一點，作者發(fā)現(xiàn)采用球囊拉傷大鼠成熟頸動脈，損傷后再狹窄的頸動脈出現(xiàn)明顯內(nèi)膜增生，血漿miRNA-21表達明顯上調(diào)；而采用基因敲除法可被動減少miRNA-21表達，損傷部位血管內(nèi)膜增生狀況得到明顯改善。

本研究發(fā)現(xiàn)DM、miRNA-1、miRNA-21可作為CHD患者獨立危險因素；DM、miRNA-21可作為ISR患者獨立危險因素。進一步分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-21是CHD合并DM患者PCI術后再狹窄的獨立危險因素。ROC曲線分析結果顯示，miRNA-21和miRNA-1具有較高的敏感性和特異性，檢測血漿miRNA-1、miRNA-21含量對指導治療CHD患者、預測ISR發(fā)生及觀察PCI術后療效具有重要意義，其中miRNA-21對CHD合并DM患者具有更大預測價值。

綜上所述，DM、miRNA-1、miRNA-21與CHD及PCI術后再狹窄密切相關，但其作用機制還存在許多爭議。本研究中，miRNA-1在CHD及PCI術后再狹窄方面的研究與既往結果有所差異，但本研究有關miRNA-21在CHD及PCI術后再狹窄方面的研究與既往的結果一致。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-21對CHD合并DM患者發(fā)生ISR具有較高的預測價值，miRNA-21可能成為CHD合并DM患者ISR診斷的新途徑和治療的新靶點。