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    苯甲酸鈉對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

    2018-11-10 07:02羅燕燕程定一譚戀琴利芳云蔣星雨楊玉舒肖福英
    科技視界 2018年17期
    關(guān)鍵詞:苯甲酸鈉斑馬魚畸變

    羅燕燕 程定一 譚戀琴 利芳云 蔣星雨 楊玉舒 肖福英

    【摘 要】【目的】通過不同濃度苯甲酸鈉對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響,初步探討苯甲酸鈉的毒理性質(zhì)及對生物產(chǎn)生的影響?!痉椒ā坎捎貌煌瑵舛鹊谋郊姿徕c培養(yǎng)液,用于斑馬魚胚胎的發(fā)育影響,觀察,統(tǒng)計(jì)孵化率、孵出仔魚畸形率、死亡率等生理指標(biāo)?!窘Y(jié)果】斑馬魚直接暴露在苯甲酸鈉溶液中,8h后高濃度組(10000mg·L-1)會(huì)造成外包層變薄,16h后實(shí)驗(yàn)組卵黃形狀不規(guī)則,24h后實(shí)驗(yàn)組已出現(xiàn)黑色素的沉積,濃度大于1000mg·L-1的實(shí)驗(yàn)組存在尾部發(fā)育不全、脊柱彎曲的個(gè)體,隨苯甲酸鈉的濃度升高馬魚胚胎死亡率上升,3天后死亡率,高濃度組達(dá)30.5%,畸形率9%。與對照組有顯著性差異(P<0.05)。【結(jié)論】低濃度的苯甲酸鈉對斑馬魚胚胎發(fā)育無顯著影響,但高濃度(濃度大于1000mg·L-1時(shí))會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)生黑色素沉積、個(gè)體發(fā)育不全等畸變。

    【關(guān)鍵詞】苯甲酸鈉;斑馬魚;胚胎;畸變

    中圖分類號(hào): TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A 文章編號(hào): 2095-2457(2018)17-0077-003

    DOI:10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.17.038

    【Abstract】Objective: to preliminary discuss and explore the toxicological properties of Sodium benzoate and its effects on biological production by studying the effects of different concentrations of Sodium benzoateon zebrafish embryo development. Method: differentconcentrationsofsodium benzoate culture medium were used for the development of zebrafish embryos, and the physiological indexes such as hatching rate, hatching larval rate and mortality were observed and recorded. Result:The zebrafish was exposed directly to sodium benzoate solution. After 8h, the outer layer became thinner at high concentration(10000mg·L-1).After 16h, the shape of yolk in experimental group was irregular. After 24h, the deposition of melanin in experimental group was more than In the 1000 mg·L-1 experimental group, there was tail hypoplasia and spinal curvature. The embryo mortality of the fish increased with the concentration of sodium benzoate. After 3 days, the mortality rate was 30.5% in the high concentration group and the rateof deformity was 9%. There was significant difference with the control group(P<0.05).Conclusion: Sodium benzoate at low concentration has little effect on zebrafish embryos,but high concentrations(at concentrations above 1000mg·L-1)lead to embryonic aberrations.

    【Key words】Sodium;Benzoate;Zebrafish;Embryo;Aberration

    0 引言(Introduction)

    斑馬魚(Danio rerio)作為一種新型脊椎動(dòng)物模式生物,除了具有脊椎動(dòng)物的基本特點(diǎn),其與人類基因具有87%的同源性、器官發(fā)育與人類非常相似、胚胎透明、發(fā)育速度快,受到模式動(dòng)物研究者的高度青睞[1-2]。自1981年Streisinger等首次提出在斑馬魚上進(jìn)行發(fā)育和遺傳學(xué)的研究以來,發(fā)表了一系列利用斑馬魚進(jìn)行大規(guī)模突變體篩選的論文,成為這種新型脊椎模式動(dòng)物步入發(fā)育、遺傳和疾病研究的里程碑[3-9]。近些年,在以斑馬魚為模型進(jìn)行藥物篩選方面,也取得了一系列重要進(jìn)展[10-11]。苯甲酸鈉作為常用添加劑,廣泛用于食品、藥品、顏料、生物標(biāo)本等,在世界各地均被廣泛使用[12-15]。然而對其毒性的的影響在有些國家已經(jīng)停止生產(chǎn),并對它的使用作出限制]。目前在我國仍被作為防腐劑廣泛用于食品和藥品中,通過飲食等途徑被人體攝入,積少成多可能對人體造成一定的危害[16-20]。本文通過對斑馬魚胚胎進(jìn)行不同濃度苯甲酸鈉的培養(yǎng)液進(jìn)行染毒飼養(yǎng),檢測孵化率、孵出仔魚畸形率及死亡率等幾項(xiàng)生理指標(biāo),客觀評價(jià)苯甲酸鈉對生物的影響。

    1 材料與方法(Materials and methods)

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    野生型斑馬魚(AB品系),來源于上海佳譽(yù)水族館。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 斑馬魚胚胎的準(zhǔn)備

    挑選發(fā)育正常的野生型斑馬魚成魚雌雄交配(雌:雄=1:2),收集受精卵置于胚胎培養(yǎng)箱中恒溫孵育。胚胎發(fā)育至1h后挑選發(fā)育期同步的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)。發(fā)育至3h時(shí),將同步發(fā)育的胚胎分選到6孔板內(nèi),每孔20粒[13-15]。

    1.2.2 藥物處理

    苯甲酸鈉購置胚胎發(fā)育至3h時(shí)進(jìn)行藥物處理。小心吸出6孔板中的培養(yǎng)液,沿小室壁緩慢輕柔的加入含有待測藥物的胚胎培養(yǎng)液。輕輕分散胚胎,避免聚集。置于胚胎培養(yǎng)箱中孵育至5h發(fā)育期時(shí)換液一次,繼續(xù)培養(yǎng)至7h發(fā)育期。6組濃度分別為0mg·L-1、10mg·L-1、100mg·L-1、1000mg·L-1、10000mg·L-1的苯甲酸鈉,每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)對照組,重復(fù)實(shí)驗(yàn)10次。

    1.2.3 結(jié)果觀察與數(shù)據(jù)處理

    胚胎發(fā)育過程中,定時(shí)將斑馬魚胚胎于顯微鏡下觀察胚胎生長狀況計(jì)數(shù)并拍照記錄器生長狀態(tài)。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Results)

    2.1 胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)觀察

    斑馬魚受精卵呈半透明狀,通過普通光學(xué)顯微鏡可以很清楚地觀察到斑馬魚胚胎各時(shí)期的發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)共觀察了對照組斑馬魚胚胎發(fā)育的五個(gè)時(shí)段,各時(shí)段形態(tài)學(xué)特征見表一。對照組(A)以及各劑量組(B~E)斑馬魚不同發(fā)育時(shí)期的形態(tài)學(xué)變化見圖1 。

    從圖1 觀察到受精后4小時(shí),對照組及苯甲酸鈉實(shí)驗(yàn)組囊胚發(fā)育正常,發(fā)育8h,對照組出現(xiàn)外包活動(dòng),原腸胚開始出現(xiàn),但E組(濃度10000mg·L-1)胚胎的外包層較薄,厚度約為對照組的一半見圖1-j。16h,對照組出現(xiàn)眼泡和肌節(jié),苯甲酸鈉實(shí)驗(yàn)組卵黃形狀普遍為不規(guī)則形。24h后差異更加明顯,對照組尾部開始延伸并脫離卵黃,實(shí)驗(yàn)組已出現(xiàn)黑色素的沉積,同時(shí)其中濃度大于1000mg·L-1的實(shí)驗(yàn)組存在尾部發(fā)育不全、彎曲的突變個(gè)體(見圖1-t)。48h時(shí),對照組斑馬魚的黑色素開始沉積。實(shí)驗(yàn)組黑色素沉積相對較多,其中還存在脊柱彎曲的畸變現(xiàn)象見圖1-x。

    2.2 胚胎死亡率及畸變率觀察

    10次實(shí)驗(yàn),每組共獲得200粒受精卵,發(fā)育3天后的死亡率及畸變率見表二,不同濃度苯甲酸鈉對斑馬魚胚胎死亡率(圖2)及畸變率的影響見圖3。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(Analysis)

    根據(jù)卡方檢測可得,當(dāng)苯甲酸鈉濃度為10 mg·L-1時(shí),死亡率9.5%,P<0.05;實(shí)驗(yàn)組與對照組有顯著的差異,當(dāng)濃度大于100 mg·L-1時(shí),死亡率從11.5%-30.%,P<0.01;實(shí)驗(yàn)組與對照組有極顯著的差異。

    4 討論(Discussion)

    生物在胚胎發(fā)育早期極易受外界環(huán)境的影響,會(huì)造成死胎、畸形等,本研究低濃度苯甲酸鈉對斑馬魚胚胎畸變率的影響不是很明顯,當(dāng)濃度升高到1000mg·L-1時(shí),斑馬魚胚胎開始出現(xiàn)畸變,畸變率為3.5%,當(dāng)苯甲酸鈉濃度上升到10000mg·L-1時(shí),斑馬魚畸變率升高至9%,所以,高濃度苯甲酸鈉(濃度大于1000mg·L-1)會(huì)提高斑馬魚胚胎的畸變率。

    10mg·L-1以及100mg·L-1濃度的苯甲酸鈉對斑馬魚胚胎的死亡率無明顯影響。1000mg·L-1濃度下,斑馬魚的死亡率明顯升高。死亡率由5.5%升高到23.5%。盡管在24h時(shí)和48h時(shí),胚胎具有各方面的形態(tài),但其黑色素沉積增多。 10000mg·L-1濃度下斑馬魚胚胎的死亡率可達(dá)30.5%,出現(xiàn)了個(gè)別個(gè)體的畸變現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中死亡率與文獻(xiàn)[21]報(bào)道一致,但該文獻(xiàn)中并沒有對畸變率進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    當(dāng)濃度大于1000mg·L-1時(shí),胚胎的黑色素沉積明顯增多。黑色素的合成過程中,絡(luò)氨酸酶是關(guān)鍵酶,其催化黑色素合成途徑中的兩個(gè)初始步驟,即絡(luò)氨酸羥基化成3,4-二羥基苯丙氨酸(DOPA)和DOPA氧化成多巴醌。然后多巴醌可由兩條獨(dú)立的途徑生成黑色素。整個(gè)合成過程涉及了眼皮膚白化病二型(OCA2)、絡(luò)氨酸酶(TYR)、多巴色素互變酶(DCT)、絡(luò)氨酸酶相關(guān)蛋白等多個(gè)基因,可推測黑色素沉積可能是苯甲酸鈉濃度上升使黑色素合成機(jī)制代謝旺盛,比如導(dǎo)致絡(luò)氨酸酶的分泌增加,或是導(dǎo)致胚胎的相關(guān)基因發(fā)生突變,使得這些基因表達(dá),這一結(jié)果可對人類皮膚黑色素疾病方面的研究有一定的提示。

    5 結(jié)論(Conclusions)

    本研究可得出如下結(jié)論:一定濃度的苯甲酸鈉能夠影響斑馬魚的胚胎發(fā)育,造成胚胎發(fā)育遲緩,黑色素沉積和畸變率上升。其中死亡率與苯甲酸鈉濃度呈正相關(guān),所得死亡率的P值均小于0.05,認(rèn)為實(shí)得資料與理論比例間有顯著差異。苯甲酸鈉在低濃度情況下并未造成胚胎發(fā)育的異常,可適量添加于藥品及食品中充當(dāng)防腐劑,但濃度大于1000mg·L-1時(shí),可對生物體造成傷害。

    【參考文獻(xiàn)】(References)

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