苯甲酸鈉對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

羅燕燕　程定一　譚戀琴　利芳云　蔣星雨　楊玉舒　肖福英

【摘 要】【目的】通過不同濃度苯甲酸鈉對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響，初步探討苯甲酸鈉的毒理性質(zhì)及對生物產(chǎn)生的影響?！痉椒ā坎捎貌煌瑵舛鹊谋郊姿徕c培養(yǎng)液，用于斑馬魚胚胎的發(fā)育影響，觀察，統(tǒng)計(jì)孵化率、孵出仔魚畸形率、死亡率等生理指標(biāo)?！窘Y(jié)果】斑馬魚直接暴露在苯甲酸鈉溶液中，8h后高濃度組（10000mg·L-1）會(huì)造成外包層變薄，16h后實(shí)驗(yàn)組卵黃形狀不規(guī)則，24h后實(shí)驗(yàn)組已出現(xiàn)黑色素的沉積，濃度大于1000mg·L-1的實(shí)驗(yàn)組存在尾部發(fā)育不全、脊柱彎曲的個(gè)體，隨苯甲酸鈉的濃度升高馬魚胚胎死亡率上升，3天后死亡率，高濃度組達(dá)30.5%，畸形率9%。與對照組有顯著性差異（P<0.05）。【結(jié)論】低濃度的苯甲酸鈉對斑馬魚胚胎發(fā)育無顯著影響，但高濃度（濃度大于1000mg·L-1時(shí)）會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)生黑色素沉積、個(gè)體發(fā)育不全等畸變。

【關(guān)鍵詞】苯甲酸鈉；斑馬魚；胚胎；畸變

中圖分類號(hào)： TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 2095-2457（2018）17-0077-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.17.038

【Abstract】Objective： to preliminary discuss and explore the toxicological properties of Sodium benzoate and its effects on biological production by studying the effects of different concentrations of Sodium benzoateon zebrafish embryo development. Method： differentconcentrationsofsodium benzoate culture medium were used for the development of zebrafish embryos， and the physiological indexes such as hatching rate， hatching larval rate and mortality were observed and recorded. Result：The zebrafish was exposed directly to sodium benzoate solution. After 8h， the outer layer became thinner at high concentration（10000mg·L-1）.After 16h， the shape of yolk in experimental group was irregular. After 24h， the deposition of melanin in experimental group was more than In the 1000 mg·L-1 experimental group， there was tail hypoplasia and spinal curvature. The embryo mortality of the fish increased with the concentration of sodium benzoate. After 3 days， the mortality rate was 30.5% in the high concentration group and the rateof deformity was 9%. There was significant difference with the control group（P<0.05）.Conclusion： Sodium benzoate at low concentration has little effect on zebrafish embryos，but high concentrations（at concentrations above 1000mg·L-1）lead to embryonic aberrations.

【Key words】Sodium；Benzoate；Zebrafish；Embryo；Aberration

0 引言（Introduction）

斑馬魚（Danio rerio）作為一種新型脊椎動(dòng)物模式生物，除了具有脊椎動(dòng)物的基本特點(diǎn)，其與人類基因具有87%的同源性、器官發(fā)育與人類非常相似、胚胎透明、發(fā)育速度快，受到模式動(dòng)物研究者的高度青睞[1-2]。自1981年Streisinger等首次提出在斑馬魚上進(jìn)行發(fā)育和遺傳學(xué)的研究以來，發(fā)表了一系列利用斑馬魚進(jìn)行大規(guī)模突變體篩選的論文，成為這種新型脊椎模式動(dòng)物步入發(fā)育、遺傳和疾病研究的里程碑[3-9]。近些年，在以斑馬魚為模型進(jìn)行藥物篩選方面，也取得了一系列重要進(jìn)展[10-11]。苯甲酸鈉作為常用添加劑，廣泛用于食品、藥品、顏料、生物標(biāo)本等，在世界各地均被廣泛使用[12-15]。然而對其毒性的的影響在有些國家已經(jīng)停止生產(chǎn)，并對它的使用作出限制]。目前在我國仍被作為防腐劑廣泛用于食品和藥品中，通過飲食等途徑被人體攝入，積少成多可能對人體造成一定的危害[16-20]。本文通過對斑馬魚胚胎進(jìn)行不同濃度苯甲酸鈉的培養(yǎng)液進(jìn)行染毒飼養(yǎng)，檢測孵化率、孵出仔魚畸形率及死亡率等幾項(xiàng)生理指標(biāo)，客觀評價(jià)苯甲酸鈉對生物的影響。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野生型斑馬魚（AB品系），來源于上海佳譽(yù)水族館。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 斑馬魚胚胎的準(zhǔn)備

挑選發(fā)育正常的野生型斑馬魚成魚雌雄交配（雌：雄=1：2），收集受精卵置于胚胎培養(yǎng)箱中恒溫孵育。胚胎發(fā)育至1h后挑選發(fā)育期同步的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)。發(fā)育至3h時(shí)，將同步發(fā)育的胚胎分選到6孔板內(nèi)，每孔20粒[13-15]。

1.2.2 藥物處理

苯甲酸鈉購置胚胎發(fā)育至3h時(shí)進(jìn)行藥物處理。小心吸出6孔板中的培養(yǎng)液，沿小室壁緩慢輕柔的加入含有待測藥物的胚胎培養(yǎng)液。輕輕分散胚胎，避免聚集。置于胚胎培養(yǎng)箱中孵育至5h發(fā)育期時(shí)換液一次，繼續(xù)培養(yǎng)至7h發(fā)育期。6組濃度分別為0mg·L-1、10mg·L-1、100mg·L-1、1000mg·L-1、10000mg·L-1的苯甲酸鈉，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)對照組，重復(fù)實(shí)驗(yàn)10次。

1.2.3 結(jié)果觀察與數(shù)據(jù)處理

胚胎發(fā)育過程中，定時(shí)將斑馬魚胚胎于顯微鏡下觀察胚胎生長狀況計(jì)數(shù)并拍照記錄器生長狀態(tài)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（Results）

2.1 胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)觀察

斑馬魚受精卵呈半透明狀，通過普通光學(xué)顯微鏡可以很清楚地觀察到斑馬魚胚胎各時(shí)期的發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)共觀察了對照組斑馬魚胚胎發(fā)育的五個(gè)時(shí)段，各時(shí)段形態(tài)學(xué)特征見表一。對照組（A）以及各劑量組（B～E）斑馬魚不同發(fā)育時(shí)期的形態(tài)學(xué)變化見圖1 。

從圖1 觀察到受精后4小時(shí)，對照組及苯甲酸鈉實(shí)驗(yàn)組囊胚發(fā)育正常，發(fā)育8h，對照組出現(xiàn)外包活動(dòng)，原腸胚開始出現(xiàn)，但E組（濃度10000mg·L-1）胚胎的外包層較薄，厚度約為對照組的一半見圖1-j。16h，對照組出現(xiàn)眼泡和肌節(jié)，苯甲酸鈉實(shí)驗(yàn)組卵黃形狀普遍為不規(guī)則形。24h后差異更加明顯，對照組尾部開始延伸并脫離卵黃，實(shí)驗(yàn)組已出現(xiàn)黑色素的沉積，同時(shí)其中濃度大于1000mg·L-1的實(shí)驗(yàn)組存在尾部發(fā)育不全、彎曲的突變個(gè)體（見圖1-t）。48h時(shí)，對照組斑馬魚的黑色素開始沉積。實(shí)驗(yàn)組黑色素沉積相對較多，其中還存在脊柱彎曲的畸變現(xiàn)象見圖1-x。

2.2 胚胎死亡率及畸變率觀察

10次實(shí)驗(yàn)，每組共獲得200粒受精卵，發(fā)育3天后的死亡率及畸變率見表二，不同濃度苯甲酸鈉對斑馬魚胚胎死亡率（圖2）及畸變率的影響見圖3。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（Analysis）

根據(jù)卡方檢測可得，當(dāng)苯甲酸鈉濃度為10 mg·L-1時(shí)，死亡率9.5%，P<0.05；實(shí)驗(yàn)組與對照組有顯著的差異，當(dāng)濃度大于100 mg·L-1時(shí)，死亡率從11.5%-30.%，P<0.01；實(shí)驗(yàn)組與對照組有極顯著的差異。

4 討論（Discussion）

生物在胚胎發(fā)育早期極易受外界環(huán)境的影響，會(huì)造成死胎、畸形等，本研究低濃度苯甲酸鈉對斑馬魚胚胎畸變率的影響不是很明顯，當(dāng)濃度升高到1000mg·L-1時(shí)，斑馬魚胚胎開始出現(xiàn)畸變，畸變率為3.5%，當(dāng)苯甲酸鈉濃度上升到10000mg·L-1時(shí)，斑馬魚畸變率升高至9%，所以，高濃度苯甲酸鈉（濃度大于1000mg·L-1）會(huì)提高斑馬魚胚胎的畸變率。

10mg·L-1以及100mg·L-1濃度的苯甲酸鈉對斑馬魚胚胎的死亡率無明顯影響。1000mg·L-1濃度下，斑馬魚的死亡率明顯升高。死亡率由5.5%升高到23.5%。盡管在24h時(shí)和48h時(shí)，胚胎具有各方面的形態(tài)，但其黑色素沉積增多。 10000mg·L-1濃度下斑馬魚胚胎的死亡率可達(dá)30.5%，出現(xiàn)了個(gè)別個(gè)體的畸變現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中死亡率與文獻(xiàn)[21]報(bào)道一致，但該文獻(xiàn)中并沒有對畸變率進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

當(dāng)濃度大于1000mg·L-1時(shí)，胚胎的黑色素沉積明顯增多。黑色素的合成過程中，絡(luò)氨酸酶是關(guān)鍵酶，其催化黑色素合成途徑中的兩個(gè)初始步驟，即絡(luò)氨酸羥基化成3，4-二羥基苯丙氨酸（DOPA）和DOPA氧化成多巴醌。然后多巴醌可由兩條獨(dú)立的途徑生成黑色素。整個(gè)合成過程涉及了眼皮膚白化病二型（OCA2）、絡(luò)氨酸酶（TYR）、多巴色素互變酶（DCT）、絡(luò)氨酸酶相關(guān)蛋白等多個(gè)基因，可推測黑色素沉積可能是苯甲酸鈉濃度上升使黑色素合成機(jī)制代謝旺盛，比如導(dǎo)致絡(luò)氨酸酶的分泌增加，或是導(dǎo)致胚胎的相關(guān)基因發(fā)生突變，使得這些基因表達(dá)，這一結(jié)果可對人類皮膚黑色素疾病方面的研究有一定的提示。

5 結(jié)論（Conclusions）

本研究可得出如下結(jié)論：一定濃度的苯甲酸鈉能夠影響斑馬魚的胚胎發(fā)育，造成胚胎發(fā)育遲緩，黑色素沉積和畸變率上升。其中死亡率與苯甲酸鈉濃度呈正相關(guān)，所得死亡率的P值均小于0.05，認(rèn)為實(shí)得資料與理論比例間有顯著差異。苯甲酸鈉在低濃度情況下并未造成胚胎發(fā)育的異常，可適量添加于藥品及食品中充當(dāng)防腐劑，但濃度大于1000mg·L-1時(shí)，可對生物體造成傷害。

【參考文獻(xiàn)】（References）

[1]E Mucciarelli.Quotations in Vedic Literature：Is the Changing of a Mantra a Stylistic Device or the Degeneration of a“Beautiful Mind？”[J].Journal of Indian Philosophy，2015，43（4-5）.

[2]高波，陳才，張麗，沈丹，王賽賽，陳偉，王偉，產(chǎn)舒恒，宋成義.環(huán)境污染物對斑馬魚早期胚胎轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2017，41（11）：1660-1666.

[3]賈順姬，孟安明.中國斑馬魚研究發(fā)展歷程及現(xiàn)狀[J].遺傳，2012，34（9）：1082-1088.

[4]Muhannmad Shafi. Long-term Exposure of Three Plasticizers of Di-（2-ethylhexyl） Phthalate，Dibutyl Phthalate and Acetyl Tributyl Citrate：Individual and Combined Toxic Effects on the Development and Reproduction of Zebrafish （Danio Rerio）[D].中國海洋大學(xué)，2015.

[5]吳謙，胡逸華，吳承玫.“斑馬魚早期胚胎發(fā)育”創(chuàng)新型觀察實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)[J].生物學(xué)教學(xué)，2018，43（01）：59-60.

[6]ZHANG W，SUN W F，AN S，et al.Acute and chronic toxic effects of chloramphenicol on Scenedesmus obliquus and Chlorella pyrenoidosa[J].Water Environ Res，2013，85（8）：725-732.

[7]張?jiān)?，吳媛，陳維云，等. 異煙肼對斑馬魚胚胎發(fā)育量-毒關(guān)系的研究 [J].山東科學(xué)，2015，28（ 5） ： 14-21.

[8]Hong Zhang， Lijuan Zhao. Influence of sublethal doses of acetamiprid and halosulfuron-methyl on metabolites of zebra fish （Brachydanio rerio）[J]. Aquatic Toxicology，2017，191.

[9]王榮春，何秋霞，韓建，陳錫強(qiáng)，孫晨，王希敏，韓利文，劉可春.氯霉素對斑馬魚幼魚發(fā)育及免疫毒性的研究[J].山東科學(xué)，2017，30（06）：35-40.

[10]嚴(yán)麗鋒，顧爰華.利用斑馬魚胚胎進(jìn)行發(fā)育毒理學(xué)研究的進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，31（3）：346-350.

[11]Xia J G，Niu C J，Sun L Y.Ecotoxicological effects of exposure to PFOS on embryo and larva of zabrafish Danio rerio.ActaEcologicaSinica， 2013， 33（ 23） ： 7408-7416

[12]泰剛，張蕻，趙思俊，楊志敏，李洋.醋酸甲羥孕酮對斑馬魚急性毒性和生殖毒性作用研究[J].中國藥物與臨床，2017，17（10）：1451-1453.

[13]袁月親，羅世鋒，顏爾聰，尹麗陽，漆軻婧，彭亞欣，萬永奇，吳秀山，李永青.斑馬魚心臟發(fā)育候選基因Titin-Cap的CRISPR/Cas9打靶有效性分析[J].激光生物學(xué)報(bào)，2017，26（05）：458-465+457.

[14]Lantz-McPeak Susan， Guo Xiaoqing， Cuevas Elvis， etal. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.[J]. Journal of applied toxicology ： JAT，2015，35（3）.

[15]Sung Yongkang. The Typology of Jāti -s Indicated by Di？nāga and Development of Dināgas Thought[J].Journal of Indian Philosophy，2012，40（6）：

[16]張勇，賀劍輝，劉洪翠，等.斑馬魚在藥物臨床前毒理學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展及現(xiàn)狀[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2013，27（3）：482-483.