AIB1影響卵巢癌預后及增強卵巢癌對順鉑抵抗的研究

李傳棠，吳嘉俊，鄒爭志

（1.廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院婦產科，廣州511300；2.華南師范大學生物光子學研究院激光生命科學教育部重點實驗室，廣州510631；3.華南師范大學生物光子學研究院，廣東省激光生命科學重點實驗室，廣州510631）

乳腺癌擴增因子（amplified in breast cancer 1，AIB1）又稱 NCOA3、SRC3、p/CIP、RAC3、ACTR、TRAM-1，屬于核受體共激活因子（nuclear receptor coactivator，NCOA）家族，是一類相對分子質量約為160的輔激活因子，主要功能為與核受體結合并調節(jié)基因的轉錄[1]。該家族主要包括3個成員，分別是NCOAl、NCOA2、NCOA3。研究表明，NCOA家族與一些疾病的形成和發(fā)展有重要的關系，目前該家族蛋白作為疾病治療的靶點越來越受到重視，且開發(fā)出來的相應的靶向藥物已開展臨床試驗。aib1是一個重要的癌基因，關于其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的功能報導較多。現已發(fā)現aib1基因在乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌以及前列腺癌等多個激素相關的腫瘤中高度擴增，其蛋白表達也顯著升高[2-4]。在非激素相關腫瘤（如食道癌、胃癌、胰腺癌、結腸癌、泌尿道腫瘤、肝細胞癌及白血?。┲芯l(fā)現AIB1的高表達和擴增[5-6]。

Li等[4]研究表明，AIB1能與一些轉錄因子相互作用，通過激活或抑制下游基因的轉錄調控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。如其與E2F轉錄因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）、激活蛋白 1（activated protein-1，AP-1）、核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、信號傳導及轉錄激活劑6（signal transducers and activators of transcription 6，STAT6）等轉錄因子相互作用，可調控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，P13K/AKT）、胰島素樣生長因子 -1（insulin-like growth factor 1，IGF-l）等信號通路來控制腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡。Song等[6]研究發(fā)現，AIB1通過與星形膠質細胞磷酸化蛋白 3（phosphoprotein enriched in astrocytes，PEA-3）和AP-1等相互作用，促進了基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）家族蛋白的表達，從而促進了腫瘤細胞的轉移。在乳腺癌和肺癌中靶向抑制AIB1能夠明顯抑制腫瘤細胞的活力，誘導腫瘤細胞凋亡，且與組蛋白去乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑聯(lián)合使用具有協(xié)同抗腫瘤作用。另外，Wang等[7]發(fā)現，AIB1促進了乳腺癌對化療藥紫杉醇產生耐藥，且在耐藥的乳腺癌細胞中高表達。其機制在于，AIB1作為核受體亞家族5，A組，成員2（nuclear receptor subfamily 5 group A member 2，NR5A2）的激活子協(xié)同誘導乳腺癌細胞mdc1基因的轉錄，從而促進修復化療誘導的DNA損傷，導致乳腺癌化療耐藥。

在本研究中，我們首次發(fā)現AIB1與卵巢癌患者的預后相關。通過分析TCGA數據庫可知，aib1基因表達高的卵巢癌患者和順鉑治療后的卵巢癌患者的總生存期（overall survival，OS）、進展后生存期（post progression survival，PPS）以及無進展生存期（progression-free survival，PFS）均顯著降低。在卵巢癌細胞中的試驗結果也表明，AIB1促進細胞對順鉑的抵抗?？傊?，AIB1能影響卵巢癌的預后且增強卵巢癌對順鉑抵抗。

1 材料與方法

1.1 材料

順鉑（cisplatin or cis-dichlorodiammine platinum，DDP）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購買于 Sigma 公司；BCL2、BCL2L1、AIB1 和甘油醛 -3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購買于Cell Signalling Technology公司；siRNA合成于上海吉瑪公司；LipofectamineTM3000、細胞增殖試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測試劑盒、胰蛋白酶消化液購買于Thermo Scientific公司。AIB1過表達質粒由本課題組構建。

1.2 細胞培養(yǎng)

人卵巢癌細胞系（SKVO3）購于中科院上海細胞庫，本試驗采用含10%胎牛血清的杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）培養(yǎng)基，將其置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 細胞增殖檢測

取對數生長期細胞，用胰酶消化后稀釋成每毫升5×104個細胞的懸液，接種于96孔板中，每孔200 μL（即 10 000個細胞），將其放置于 37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。細胞貼壁后（至少8 h），試驗組中加入不同濃度的DDP，對照組中加入與DDP最大量等體積的DMSO，每組設8個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h。然后按照CCK-8檢測試劑盒說明書的流程完成細胞增殖檢測。流程如下：試驗中止前4 h，加入 CCK-8 液 20 μL，再培養(yǎng) 4 h，在酶聯(lián)檢測儀上檢測450 nm波長下每孔的吸光度（optical density，OD）值，按下列公式求出細胞活力。細胞活力=（用藥組平均OD值/對照組平均OD值）×100%[6]。

1.4 GEPIA分析基因表達相關性

通過在線軟件 GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）[8]分析aib1和bcl2、bcl2l1在卵巢癌組織中的相關性。軟件中Cut-off值選擇50%，分析方法采取Pearson相關性統(tǒng)計分析。

1.5 Kaplan-Meier plotter分析基因生存率

通過在線軟件 Kaplan-Meier plotter（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=contact）[9]分 別 分 析aib1基因與卵巢癌患者和順鉑治療后的卵巢癌患者的OS、PPS以及PFS。軟件中Follow up threshold參數選擇“All”，Restrict analysis to subtypes參數選擇“All”。

1.6 細胞轉染

AIB1的siRNA干擾片段序列中，siRNA-sense（有義鏈）為：5′-GGTCCTAAGGAGTCTCCTGTCTC-3′；anti-sense（無義鏈）為：5′-AAAGACTCCTTAGGACCGTTC-3′。陰性對照（negative control，NC）si-RNA中，siRNA-sense 為：5′-UCCGUUUCGGUCCACAUUC-3′；anti-sense 為：5′-GAAUGUGGACCGAAACGGA-3′。根據 LipofectamineTM3 000 說明書，轉染時用適量無血清培養(yǎng)液將siRNA（終濃度為100 nmol/L）或AIB1過表達質粒（6孔板中每孔2 μg）與 LipofectamineTM3000混勻，然后加入到細胞中，8 h后換為含10%胎牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并在轉染后48 h內完成細胞試驗[10]。

1.7 免疫印跡

收集處理過的細胞，用預冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗 3遍，加入適量的裂解液[50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、150 mmol/L Na-Cl、1%Triton X-100、1 mmol/L Na3VO4、100 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）]，在冰上裂解 30 min，12 000 r/min 離心 15 min，收集上清蛋白液。采用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，轉膜完成后，用5%奶粉液封閉，之后分別孵育一抗和二抗。A（H2O2）、B（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）液以1∶1的體積比例混合，用濾紙將膜表面液體吸干，然后加ECL（electrochemiluminescence）底物顯色液（即A、B混合液），放入暗盒中并壓片，5 s～5 min 后顯影、定影[9]。

1.8 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學方法數據均采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有試驗重復3次，均為獨立試驗。計量資料采用均數±標準差表示。數據的比較分析采取t檢驗分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 卵巢癌中高aib1基因表達與患者預后相關

為了評估aib1基因的表達與卵巢癌患者預后的關系，本研究通過Kaplan Meier plotter在線軟件，提取了TCGA數據庫中卵巢癌患者的aib1基因mRNA表達數據和預后數據，進一步進行了OS、PFS、PPS分析。OS數據完整的患者樣品共1 656例，其中aib1基因高表達1 104例，低表達552例。如圖1a所示，aib1基因高表達組的總生存率顯著低于低表達組（P=0.000 13）。PFS數據完整的患者樣品共1 435例，其中aib1基因高表達920例，低表達515例。如圖1b所示，aib1基因高表達組的無疾病進展生存率顯著低于低表達組（P=5.3×10-5）。PPS數據完整的患者樣品數目最少，共782例，其中aib1基因高表達202例，低表達580例。如圖1c所示，aib1基因高表達組的疾病進展后生存率顯著低于低表達組（P=0.039 00）。

2.2 卵巢癌中高aib1表達與經過順鉑治療的患者預后相關

化療藥DDP是臨床一線用于卵巢癌治療最常見的藥。為了評估aib1基因的表達是否與順鉑治療卵巢癌患者的療效有關，本研究通過Kaplan Meier plotter在線軟件提取了TCGA數據庫中經順鉑治療后的卵巢癌患者的數據，分析了其組織中aib1基因mRNA表達數據和預后數據，然后進行了OS、PFS、PPS分析。OS數據完整的患者樣品共1 409例，其中aib1基因高表達943例，低表達466例。如圖2a所示，aib1基因高表達組的總生存率顯著低于低表達組（P=0.006 10）。PFS數據完整的患者樣品共1 259例，其中aib1基因高表達795例，低表達464例。如圖2b所示，aib1基因高表達組的無疾病進展生存率顯著低于低表達組（P=4.7×10-6）。最后分析了PPS數據完整的患者，共746例，其中aib1基因高表達195例，低表達551例。如圖2c所示，aib1基因高表達組的疾病進展后生存率顯著低于低表達組（P=0.037 00）。

2.3 AIB1促進卵巢癌細胞對順鉑抵抗

以上試驗研究結果指出，在經過化療藥DDP治療的卵巢癌患者中，高表達aib1的基因患者OS、PPS、PFS都顯著降低，這表明aib1基因可能增強了卵巢癌對DDP的抵抗。為了直接驗證AIB1與卵巢癌細胞對DDP的敏感性有關，本研究選擇了SKVO3作為細胞模型，通過CCK-8試驗進行順鉑敏感性試驗來探討在SKVO3細胞中上調或下調AIB1表達后DDP對卵巢癌細胞活力的影響。如圖3所示，使用濃度為 0、10、20、40、80 μmol/L 的 DDP 處理細胞24 h和48 h后，完成了CCK-8試驗檢測的細胞活力。在DDP濃度為0 μmol/L時，即不存在藥物的情況下，干擾了AIB1表達后，細胞活力在24 h后減少了5.6%，在48 h后減少了10.1%，表明干擾AIB1表達能減慢細胞的增殖。在加了DDP后，隨著DDP濃度的增加，細胞的活力顯著降低。在加入40 μmol/L的DDP 24 h后，細胞活力從70%降到了45%，相對細胞活力減少了近40%（圖3a、3b），表明干擾AIB1能夠顯著增強DDP對卵巢癌細胞活力的抑制。同樣，未經過DDP處理的細胞，即DDP為0 μmol/L時，過表達AIB1的SKVO3細胞在24 h和48 h后細胞活力均有所增加，但在24h沒有顯著差異（P>0.05），而在48 h后增加了11.6%，表明過表達AIB1能適當促進卵巢癌細胞的增殖。在加入DDP后，過表達AIB1能夠顯著抑制DDP對細胞活力的抑制。如在加入濃度為80 μmol/L的DDP處理24 h后，細胞的活力從34%增加到了64%，相對細胞活力增加了近1倍。在加入不同濃度的DDP 48 h后，過表達AIB1的SKVO3細胞相對活力同樣顯著增加（圖3c、3d）。上述結果表明，AIB1增強了卵巢癌細胞對DDP的抵抗。

圖1 卵巢癌中高aib1表達與患者預后相關Fig.1 High aib1 expression is associated with poor prognosis in ovarian cancer

圖2 卵巢癌中高aib1表達與經過順鉑治療的患者預后相關Fig.2 High aib1 expression is associated with poor prognosis in ovarian cancer with cisplatin treatment

圖3 AIB1促進卵巢癌細胞對順鉑抵抗Fig.3 AIB1 enhances ovarian cells resistant to cisplatin

2.4 AIB1調節(jié)卵巢癌細胞中BCL2、BCL2XL的表達

上述結果表明，AIB1顯著增強了卵巢癌細胞對DDP的抵抗。BCL2和BCL2L1是兩個重要的調節(jié)細胞凋亡的蛋白。已有報道表明，BCL2和BCL2L1能促進癌細胞對DDP的抵抗[11]。為了解AIB1是否調節(jié)了BCL2和BCL2L1的表達，本研究在卵巢癌細胞SKVO3中，通過干擾AIB1的表達，采用Western blot方法進一步檢測了BCL2和BCL2L1的表達。結果如圖4所示，轉染AIB1干擾RNA后AIB1的表達明顯下降，同時BCL2和BCL2L1的表達也顯著下降。在SKVO3細胞中轉染了AIB1過表達質粒48 h后，AIB1的表達明顯上升，同時BCL2和BCL2L1的表達也顯著上升。這些結果表明，AIB1增強卵巢癌細胞對DDP的抵抗與BCL2和BCL2L1有關。

2.5 卵巢癌組織中bcl2、bcl2l1和 aib1基因表達顯著相關

為了繼續(xù)在卵巢癌組織中驗證aib1基因與bcl2、bcl2l1基因的表達相關。本文通過在線軟件GEPIA分析了TCGA數據庫中的卵巢癌數據，通過Pearson相關分析分析了bcl2、bcl2l1基因和aib1基因mRNA表達的相關性。如圖5a所示，bcl2和aib1表達呈正相關（r=0.22，P=2.8×10-6），而由圖 5b 可知，bcl2l1和aib1表達同樣也具有正相關性（r=0.38，P=2.8×10-16），具有統(tǒng)計學顯著意義。這些結果表明AIB1在卵巢癌細胞可能正向調控BCL2和BCL2L1的表達。

圖4 AIB1調節(jié)卵巢癌細胞中BCL2、BCL2L1的表達Fig.4 Both BCL2 and BCL2L1 are positively correlated with AIB1 in ovarian cancer

圖5 卵巢癌組織中bcl2、bcl2l1和aib1表達顯著相關Fig.5 Both bcl2 and bcl2l1 are positively correlated with aib1 in ovarian cancer

3 討論

近年來，卵巢癌在我國已成為女性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，特別是在城市女性人群中發(fā)病率仍不斷上升，總體表現為發(fā)病年齡趨向于年輕化?；熓锹殉舶┑闹饕委熓侄沃籟12]，其中DDP是臨床上用于卵巢癌治療最常用的化療藥。然而卵巢癌化療療效尚不令人滿意，原因主要為癌細胞對化療藥物的敏感性差。順鉑治療中也常發(fā)現患者對DDP的敏感性較差，并且即使是剛開始對DDP敏感的患者，在使用一段時間后便開始產生耐藥[13-14]。目前認為，癌細胞對傳統(tǒng)化療藥不敏感的根本原因在于細胞促凋亡蛋白的低表達和抑制凋亡蛋白的高表達[1]。AIB1和很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。Wang等[7]的研究表明，AIB1能夠協(xié)助肝受體同源物 1（liver receptor homolog 1，LRH1）轉錄激活DNA損傷關卡蛋白1（mediator of DNA damage checkpoint 1，MDC1）的表達并增強DNA的損傷修復能力，從而促進乳腺癌細胞對順鉑和阿霉素的耐藥。本研究發(fā)現，AIB1能促進卵巢癌細胞對順鉑抵抗，且AIB1上調了BCL2和BCL2L1的蛋白表達。BCL2和BCL2L1是控制線粒體凋亡途徑的關鍵蛋白，這兩個蛋白的高表達能夠抑制線粒體途徑的細胞凋亡。多數化療藥的抗癌活性都是通過下調BCL2和BCL2L1的表達，從而激活線粒體途徑誘導細胞的凋亡[15-16]。比如Zou等[17]的研究發(fā)現，Aurora-A抑制劑下調了BCL2的表達，從而誘導癌細胞凋亡。在非小細胞肺癌中發(fā)現硫鏈絲菌素誘導的細胞死亡也與BCL家族蛋白有關[18]。此外，DDP誘導癌細胞的凋亡也需經過線粒體途徑，并且BCL2和BCL2L1的高表達能夠抑制順鉑誘導的癌細胞凋亡[19]。因此可推斷，本研究中AIB1促進卵巢癌細胞對DDP的抵抗是通過上調BCL2和BCL2L1表達實現的。另外本研究中所用到的是TCGA數據庫中的數據，該數據庫中的基因表達數據是基因mRNA的表達量。aib1基因和bcl2、bcl2l1基因mRNA水平表達的相關性表明，AIB1可能是通過轉錄上調了BCL2、BCL2L1的水平促進了癌細胞對DPP抵抗。這需要進一步分析AIB1是否對BCL2、BCL2L1的啟動子區(qū)活性有調節(jié)，以及是否直接結合在了這兩個基因的啟動子區(qū)上?？傊?，aib1的表達高低能夠分別反映卵巢癌患者和順鉑治療后的卵巢癌患者的OS，PPS和PFS。這些結果說明，AIB1可以作為卵巢癌預后的指標以及一個治療的重要潛在靶點。