幾種殺蟲(chóng)劑對(duì)煙青蟲(chóng)抗氧化酶的影響

孟令玉，朱承美，劉世濤，曲愛(ài)軍，溫亞萌

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安岱宗大街61號(hào) 271018

煙青蟲(chóng)（Heliothis assulta(Guenée) ），屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），是我國(guó)煙草生產(chǎn)常見(jiàn)害蟲(chóng)，能造成煙葉產(chǎn)量5%～10%的損失[1-2]。近年來(lái)，防治煙青蟲(chóng)效果較好的化學(xué)藥劑主要有阿維菌素、甲維鹽、溴氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、吡蟲(chóng)啉、氯蟲(chóng)苯甲酰胺、丁醚脲等[3-6]。

化學(xué)藥劑能引起靶標(biāo)害蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)、抗氧化酶系統(tǒng)的變化[7-8]。其中，抗氧化系統(tǒng)主要包括抗氧化酶和抗氧化劑，目前對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）的研究較多[7]。李周直等人證實(shí)，溴氰菊酯處理菜粉蝶（Pieris rapae）、褐邊綠刺蛾（Parasa consocia）和褐刺蛾（Thosea pastornata）后，菜粉蝶體內(nèi)SOD、CAT、POD的活力均有提高，褐邊綠刺蛾和褐刺蛾體內(nèi)SOD、CAT活力隨中毒程度加重而不斷上升，接近死亡時(shí)又急劇下降[9]；阿維菌素和辛硫磷均可導(dǎo)致舞毒蛾幼蟲(chóng)SOD增加[10]；阿維菌素處理榆紫葉甲成蟲(chóng)24 h和36 h后，其體內(nèi)SOD活性下降[8]。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）是生物體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，可催化谷胱甘肽（GSH）產(chǎn)生氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物及促進(jìn)過(guò)氧化氫（H2O2）分解，從而保護(hù)生物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過(guò)氧化物的損害[11]。目前農(nóng)藥對(duì)昆蟲(chóng)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶影響的研究尚未報(bào)道。本研究采用防治煙青蟲(chóng)常用的6種化學(xué)藥劑處理3齡和4齡幼蟲(chóng)，測(cè)定其體內(nèi)抗氧化酶活性（SOD、CAT、POD和GPX）的變化，以期為更合理解釋害蟲(chóng)再猖獗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)與殺蟲(chóng)劑

供試煙青蟲(chóng)為3齡和4齡幼蟲(chóng)，煙青蟲(chóng)采自山東濰坊煙區(qū)2代幼蟲(chóng)。幼蟲(chóng)采回后，置于室內(nèi)用養(yǎng)蟲(chóng)籠，采集中煙100煙株生長(zhǎng)至九葉一心期的第7葉片喂飼幼蟲(chóng)，及時(shí)清除蟲(chóng)糞和食物殘?jiān)?，?shí)驗(yàn)前饑餓12 h。

25 g/L溴氰菊酯乳油（拜耳股份公司），4.5%高效氯氰菊酯乳油（江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司），200 g/L氯蟲(chóng)苯甲酰胺懸浮劑（上海生農(nóng)生化制品股份有限公司），1.8%阿維菌素乳油（寧波三江益農(nóng)化學(xué)有限公司），5%甲維鹽懸浮劑（廣東植物龍生物技術(shù)股份有限公司）和30%乙酰甲胺磷乳油（山東華陽(yáng)農(nóng)藥化工集團(tuán)有限公司）由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室免費(fèi)提供。

1.2 藥劑處理

本實(shí)驗(yàn)殺蟲(chóng)劑用量為產(chǎn)品登記的使用量上限，用蒸餾水按以下有效成份用量分別配制成藥液：溴氰菊酯2500倍、高效氯氰菊酯3000倍、氯蟲(chóng)苯甲酰胺7500倍、阿維菌素1500倍、甲維鹽4000倍和乙酰甲胺磷350倍。

供試?yán)ハx(chóng)采用葉片藥膜法處理，即選取新鮮中煙100葉片，浸于供試各殺蟲(chóng)劑藥液中5 s，葉片置于室內(nèi)陰涼處，待葉片表面水膜晾干后，喂養(yǎng)煙青蟲(chóng)幼蟲(chóng)6 h后取樣，每樣3頭用于測(cè)試，每藥劑處理重復(fù)3次，以去離子水浸葉為對(duì)照。

1.3 測(cè)試指標(biāo)

1.3.1 酶液提取

參照李周直[9]和周建云[12]等人的方法，測(cè)定樣品幼蟲(chóng)重量，幼蟲(chóng)經(jīng)磷酸緩沖液（0.02 mol·L-1，pH 7.2）漂洗，擦干后放入適量PBS，冰浴中研磨成勻漿，4℃下，20000 r·min-1離心20 min，上清液即為酶提取液。

1.3.2 測(cè)試指標(biāo)與方法

采用SOD測(cè)定試劑盒（A001-3，南京建成生物工程研究所）檢測(cè)SOD活性，采用CAT測(cè)定試劑盒（A007-1-1）檢測(cè)CAT活性，采用POD測(cè)定試劑盒（A084-3）檢測(cè)POD活性。

采用愈創(chuàng)木酚法[11]測(cè)定GPX活性，GPX反應(yīng)液為100 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 6.0)，含有15 mmol/L愈創(chuàng)木酚、3 mmol/L H2O2。取3 mL反應(yīng)液，加入20 μL酶液，于470 nm波長(zhǎng)下比色，每隔1 min記錄吸光度，共記錄3次。GPX酶活性以每分鐘內(nèi)A470增加0.01為一個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位（U·mg-1）。

其中，△A470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化，V為提取酶液總體積（mL）； Vs為測(cè)定時(shí)所取酶液體積（mL）；W為樣重（g）；T為反應(yīng)時(shí)間（min）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0 處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種殺蟲(chóng)劑對(duì)3齡幼蟲(chóng)抗氧化酶活性的影響

由表1數(shù)據(jù)可以看出，施藥6 h后，6種殺蟲(chóng)劑均能引起3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)SOD、POD、CAT和GPX活性的上升。溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、阿維菌素、乙酰甲胺磷和甲維鹽處理后，與對(duì)照相比，SOD、POD、CAT和GPX活性均顯著上升。其中溴氰菊酯處理后， SOD活性上升了43.24%，POD活性上升了84.49%，CAT活性上升了47.33%，GPX活性上升了31.23%，與對(duì)照差異極顯著。而氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理后，SOD活性雖比對(duì)照組上升了4.55%，POD活性上升了3.27%，CAT活性上升了4.12%，GPX活性上升了4.49%，與對(duì)照相比差異均未達(dá)到顯著水平。

表1 6種殺蟲(chóng)劑對(duì)3齡幼蟲(chóng)抗氧化酶活性的影響Tab.1 Effects of six insecticides on the activity of antioxidase in three instar larvae

2.2 6種殺蟲(chóng)劑對(duì)4齡幼蟲(chóng)抗氧化酶活性的影響

表2中的數(shù)據(jù)顯示，6種殺蟲(chóng)劑處理6 h后，均能不同程度提高煙青蟲(chóng)4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶的活性。溴氰菊酯處理后，各項(xiàng)抗氧化酶增加最為明顯，其中，SOD活性上升了42.05%，POD活性上升了83.02%，CAT活性上升了45.22%，GPX活性上升了30.37%，各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照差異均顯著。與對(duì)照相比，高效氯氰菊酯、阿維菌素、乙酰甲胺磷和甲維鹽處理后，4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶的活性均顯著上升。氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理后，SOD活性與對(duì)照相比上升了4.43%，POD活性上升了3.21%，CAT活性上升了4.04%，GPX活性上升了4.11%，但差異均不顯著。

表2 6種殺蟲(chóng)劑對(duì)4齡幼蟲(chóng)抗氧化酶活性的影響Tab.2 Effects of six insecticides on the activity of antioxidase in four instar larvae

3 討論與結(jié)論

昆蟲(chóng)在逆境脅迫（含農(nóng)藥）下，體內(nèi)通過(guò)抗氧化酶和抗氧化劑系統(tǒng)抵御活性氧損傷，抗氧化酶系統(tǒng)是公認(rèn)的普遍存在于生物體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)[13]，昆蟲(chóng)在各種脅迫因子作用下，如農(nóng)藥、寄生、紫外線[14]、熱、冷等，抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)是消除脅迫途徑之一。昆蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶主要有SOD、CAT、POD[7,9]、谷胱甘肽還原酶（GR）、硫氧還蛋白還原酶（TrxR）[15]、酚氧化酶（PO）[16]等，抗氧化劑有黑色素[17]、GSH[18]、β-胡蘿卜素和維生素E[19]等。

SOD是生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，消除超氧化物陰離子自由基，產(chǎn)生H2O2[20]。褐飛虱（Nilaparvata lugens） 等昆蟲(chóng)在溴氰菊酯等處理后，昆蟲(chóng)體內(nèi)SOD 活性均有不同程度增加[21,9]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明昆蟲(chóng)本身能提高SOD酶活性，以適應(yīng)農(nóng)藥毒害的影響。POD是由微生物或植物所產(chǎn)生的一類氧化還原酶，主要位于過(guò)氧化物酶體中，具有清除過(guò)氧化氫，消除胺類和酚類毒性的作用[11]。本研究幼蟲(chóng)經(jīng)6種殺蟲(chóng)劑處理后，POD活性均較對(duì)照有所上升，說(shuō)明供試殺蟲(chóng)劑能夠激活煙青蟲(chóng)體內(nèi)POD活性，以清除殺蟲(chóng)劑毒害。CAT是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶，是清除細(xì)胞內(nèi)H2O2的主要酶類[22]。在高濃度吡蟲(chóng)啉、低濃度滅幼脲、百樹(shù)菊酯和功夫菊酯脅迫下，榆紫葉甲成蟲(chóng)CAT活性提高，與本研究結(jié)果相吻合，表明CAT也是昆蟲(chóng)應(yīng)對(duì)農(nóng)藥毒害途徑之一。GPX的功能是分解是過(guò)氧化物和H2O2[11]。本研究幼蟲(chóng)經(jīng)6種殺蟲(chóng)劑處理后，GPX活性均較對(duì)照有所上升，表明GPX也是煙青蟲(chóng)清除供試殺蟲(chóng)劑毒害途徑之一。

本研究分別測(cè)定了溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、阿維菌素、乙酰甲胺磷、甲維鹽和氯蟲(chóng)苯甲酰胺對(duì)3齡和4齡煙青蟲(chóng)幼蟲(chóng)體內(nèi)SOD、POD、CAT和GPX4種抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，經(jīng)6種殺蟲(chóng)劑處理后，3齡和4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)4種抗氧化酶活性均有上升，且3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)四種酶活性的增幅稍高于4齡幼蟲(chóng)。溴氰菊酯處理的酶活變化最明顯，其次為高效氯氰菊酯、阿維菌素、乙酰甲胺磷和甲維鹽，與對(duì)照均有顯著差異，而氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理后，4種酶活性與對(duì)照相比差異均不顯著。

化學(xué)農(nóng)藥在生產(chǎn)使用過(guò)程中，通常會(huì)引起害蟲(chóng)3R問(wèn)題，而昆蟲(chóng)體內(nèi)這些抗氧化酶和物質(zhì)與害蟲(chóng)再猖獗及抗性有何種關(guān)系，以及昆蟲(chóng)體內(nèi)由哪些抗氧化酶和物質(zhì)組成，均有待于進(jìn)一步探討和研究。