羅繼鵬，陶琦，吳可人，李廷強(qiáng)

（浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，污染環(huán)境修復(fù)與生態(tài)健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310058）

重金屬超積累植物是指能夠超量吸收和積累重金屬的植物，其體內(nèi)的重金屬含量要達(dá)到普通植物的100倍以上[1]，其典型特征是重金屬的運(yùn)轉(zhuǎn)系數(shù)和富集系數(shù)都大于1[1-2]。超積累植物對(duì)重金屬的吸收和積累主要受到植物種類、土壤類型、污染程度和根際環(huán)境的影響[3]。定殖在超積累植物根際或根內(nèi)的細(xì)菌或真菌在植物與土壤互作過程中發(fā)揮著非常重要的作用[4-5]。這些微生物能夠耐受高濃度的重金屬，影響土壤重金屬的溶解性和生物有效性，影響宿主植物的生長和發(fā)育及其對(duì)重金屬的吸收或耐受能力，最終影響植物對(duì)重金屬超積累能力和植物提取修復(fù)效率[6-8]。盡管有些根際細(xì)菌和內(nèi)生菌發(fā)揮著相似的功能，但大量研究表明，植物內(nèi)生菌的有益作用要強(qiáng)于很多根際細(xì)菌[9]，且該有益作用在生物或非生物脅迫條件下會(huì)被進(jìn)一步放大[10]。本文從超積累植物內(nèi)生微生物的群落組成特征及演替規(guī)律、對(duì)植物生長和重金屬吸收積累的影響及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

1 植物內(nèi)生微生物組成特征及其演替規(guī)律

內(nèi)生微生物是指定殖在植物組織內(nèi)部與宿主植物形成互惠共生關(guān)系，而不給宿主植物造成癥狀性感染或不利影響的一類微生物[11-12]。通常，內(nèi)生微生物定殖在植物的質(zhì)外體和共質(zhì)體空間。與根際微生物群落一樣，內(nèi)生微生物群落也受到生物和非生物因子的調(diào)控[13-14]，但是內(nèi)生微生物比根際微生物能更好地保護(hù)植物免受生物和非生物脅迫[15]。生長在不同環(huán)境中的植物內(nèi)生微生物的群落組成和功能特征各不相同[5]。

以普通植物內(nèi)生微生物形成機(jī)制為例，研究發(fā)現(xiàn)：生長在2個(gè)不同地點(diǎn)的楊樹（Populus deltoides）的內(nèi)生細(xì)菌和真菌群落組成與根際微生物群落顯著不同；利用16S rRNA焦磷酸測(cè)序發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生微生物群落豐度下降了1個(gè)數(shù)量級(jí)，且被變形菌門細(xì)菌所主導(dǎo)，而根際微生物群落被酸桿菌門所主導(dǎo)，但它在植物根內(nèi)的豐度卻很低[16]。這一研究結(jié)果表明，植物根內(nèi)微生物群落并非由根際土壤微生物偶然入侵定殖形成。此外，對(duì)擬南芥根部細(xì)菌群落的研究發(fā)現(xiàn)，根內(nèi)細(xì)菌群落與根際和不種植植物的土壤細(xì)菌群落的組成和多樣性差別巨大[17-18]。值得注意的是，在上述研究中，盡管擬南芥種植在2個(gè)大陸的4種不同土壤中，其根內(nèi)細(xì)菌群落的分類學(xué)圖譜卻顯著地相似，主要是放線菌門、擬桿菌門和變形菌門。這些結(jié)果進(jìn)一步證明，植物根內(nèi)微生物群落并不是由根際微生物偶然入侵定殖形成的，并且由此推測(cè)，根際與內(nèi)生微生物群落差異是由不同宿主植物所具有的不同調(diào)節(jié)機(jī)制造成的。

BULGARELLI等[5]結(jié)合大量的文獻(xiàn)報(bào)道提出了植物根內(nèi)微生物群落形成的“兩步法”選擇模型理論，它解釋了根內(nèi)微生物群落與根系周圍土壤微生物群落之間逐漸出現(xiàn)差異的原因（圖1）。在該模型中，土壤多因子決定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。在第一步選擇過程中，根際沉積物為最初由底物驅(qū)動(dòng)的根際微生物群落的演化提供了養(yǎng)分物質(zhì)；隨后，在第二步選擇過程中，依賴宿主植物基因型的趨同選擇性作用進(jìn)一步影響根表和根內(nèi)微生物群落組成。因此，在根際土壤中由底物驅(qū)動(dòng)的微生物選擇作用可能會(huì)一直延伸至植物組織內(nèi)部。相比于植物體內(nèi)環(huán)境，在根際區(qū)域微生物的選擇規(guī)模隨著植物種類和宿主植物基因型功能的不同而表現(xiàn)出巨大的差異。EDWARDS等[19]以水稻為研究材料，采用大規(guī)模Illumina高通量測(cè)序佐證了植物內(nèi)生菌形成的“兩步法”理論。在一系列可能造成根際和根內(nèi)微生物群落組成差異的因子中，植物固有的免疫系統(tǒng)是促成根內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)形成的重要因素。植物自身進(jìn)化出了一套精密的免疫系統(tǒng)，它由2類可以識(shí)別宿主植物細(xì)胞內(nèi)部和表面非自我分子的免疫受體組成[20]。非自我識(shí)別組分可以通過激活植物體內(nèi)強(qiáng)大的免疫應(yīng)激功能來終止病原微生物的增殖。植物根內(nèi)微生物群落擁有特定的分類學(xué)結(jié)構(gòu)，這與當(dāng)前植物固有的免疫框架理論相吻合，即這類微生物可能像病原微生物一樣擁有免疫反應(yīng)攔截功能[21]。此外，內(nèi)生微生物可能進(jìn)化出了針對(duì)微生物的高效偽裝機(jī)制（microbe-associated molecular patterns,MAMPs），巧妙地避開免疫受體識(shí)別。最后一種可能是，當(dāng)內(nèi)生微生物開始定殖時(shí)植物的固有免疫系統(tǒng)已經(jīng)被激活，但是該免疫系統(tǒng)能將微生物的繁殖速率限制在一定程度內(nèi)，使其遠(yuǎn)低于可以造成疾病癥狀的病原性細(xì)菌豐度。所以，未來有必要對(duì)這3種模型進(jìn)行區(qū)分，即使這3種理論模型并不相互排斥。綜上，目前對(duì)植物的根際、根內(nèi)或葉部微生物群落組成、功能特征及其演替規(guī)律做了很多研究，并獲得了大量的研究結(jié)果。但這些研究主要針對(duì)普通植物或作物，涉及環(huán)境特異性植物如重金屬超積累植物內(nèi)生微生物的形成或演替機(jī)制的研究仍未見報(bào)道。與普通植物不同的是，超積累植物的生長環(huán)境較為極端，大多數(shù)內(nèi)生微生物對(duì)極端環(huán)境也有很強(qiáng)的耐性和適應(yīng)能力。因此，超積累植物內(nèi)生微生物群落形成過程勢(shì)必會(huì)不同于普通植物，揭示其內(nèi)生微生物群落的形成機(jī)制將有助于我們進(jìn)一步揭示植物內(nèi)生微生物的裝配或演替規(guī)律。

圖1 植物根內(nèi)微生物群落形成的“兩步法”選擇過程[5,19]Fig.1 Atwo-step selection model for root microbiota differentiation[5,19]

2 超積累植物內(nèi)生微生物群落組成和多樣性特征

土壤重金屬污染不僅影響植物的生長，同時(shí)還會(huì)改變與植物相關(guān)聯(lián)的微生物群落數(shù)量、組成和活性[22]。大量研究表明，不同類型的重金屬污染會(huì)影響宿主植物內(nèi)生菌群落的多樣性、生物量及活性[23]。細(xì)菌受到重金屬脅迫后，對(duì)重金屬更敏感的種群首先死亡，存活下來的細(xì)菌進(jìn)行后續(xù)的競爭和適應(yīng)，最終形成的土壤細(xì)菌群落對(duì)重金屬的抗性會(huì)增強(qiáng)[24]?？傮w上，超積累植物體內(nèi)的高濃度重金屬為能夠耐受高濃度重金屬脅迫的內(nèi)生微生物提供了一個(gè)特殊的生存環(huán)境[25]，因此定殖在其中的微生物群落與普通植物中的內(nèi)生微生物群落組成差異巨大。一方面，在超積累植物不同根際空間內(nèi)的微生物群落組成和多樣性存在明顯的差異。如鋅鎘超積累植物東南景天（Sedum alfredii）根際和根內(nèi)細(xì)菌群落組成差異明顯，根際主要由變形菌門中的鞘脂單胞菌科組成，而根內(nèi)主要由放線菌門中的鏈霉菌科所主導(dǎo)，且群落的α-多樣性指數(shù)從根際到根內(nèi)呈明顯的下降趨勢(shì)[26]。另一方面，超積累植物不同器官或組織因其積累的重金屬含量的不同而導(dǎo)致定殖在不同組織內(nèi)的細(xì)菌群落組成有差異。利用可培養(yǎng)方法對(duì)超積累植物Thlaspi goesingense的內(nèi)生菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其地上部和根部的內(nèi)生菌群對(duì)重金屬表現(xiàn)出了不同的耐受能力，說明在超積累植物不同組織內(nèi)定殖著不同的微生物類群，且大部分內(nèi)生菌主要由嗜中溫甲基桿菌（Methylobacterium mesophilicum）（占近20%）和鞘氨醇單胞菌組成，這類細(xì)菌比定殖在根際內(nèi)的細(xì)菌能夠耐受更高濃度的鎳（Ni）。此外，超積累植物的內(nèi)生菌群落與其他種類植物（如非超積累植物或普通植物）的內(nèi)生菌落相比也存在巨大差異。如生長在富硒土壤中的硒超積累植物Stanleya pinnata（十字花科）和Astragalus bisulcatus（豆科）與分別隸屬于同一個(gè)科的非超積累植物Physaria bellii（十字花科）、紫花苜蓿Medicago sativa（豆科）相比，兩者間內(nèi)生菌群落差異明顯，且超積累植物內(nèi)生菌大都能夠耐受高濃度的硒酸鹽和亞硒酸鹽，并能將它們還原成元素態(tài)硒，但是超積累與非超積累生態(tài)型之間的內(nèi)生菌群落多樣性差異卻很小[27]。在超積累和非超積累生態(tài)型東南景天中，兩者間的內(nèi)生菌群落差異主要體現(xiàn)在擬桿菌門、厚壁菌門和浮霉菌門的豐度差異上，且超積累生態(tài)型根內(nèi)細(xì)菌群落的α-多樣性指數(shù)總體上低于非超積累生態(tài)型[26]。

目前，從不同的重金屬超積累植物伯士隆庭薺（Alyssum bertolonii）、天 藍(lán) 遏 藍(lán) 菜（Noccaea caerulescens）、Thlaspi goesingense、普 通 煙 草（Nicotiana tabacum）、沙漠王羽（Stanleya pinnata）和雙槽紫云英（Astragalus bisulcatus）體內(nèi)分離出了大量耐受重金屬的內(nèi)生菌[25,27-29]（表1）。在大部分超積累植物體內(nèi)，變形菌門的細(xì)菌豐度最高，并且鞘氨醇單胞菌屬（α-變形菌綱）在多種超積累植物體內(nèi)都能被分離得到[25,29-36]，說明該類細(xì)菌在超積累植物體內(nèi)具備強(qiáng)大的生理代謝和適應(yīng)能力，并且可能為植物適應(yīng)非生物脅迫提供有益的幫助。微生物-超積累植物-土壤三者之間的相互作用促使植物體內(nèi)形成了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的內(nèi)生菌群落，其在門分類學(xué)水平上主要由變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和綠彎菌門組成[25-26,37]，并且它們的組成特征隨著植物種類、土壤類型和污染程度的不同表現(xiàn)出巨大的差異。例如，SCHLAEPPI等[37]將鋅鎘超積累擬南芥（Arabidopsis halleri）與其具有親緣關(guān)系的4種擬南芥植物分別培養(yǎng)在2種不同的土壤中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾種植物的根部內(nèi)生細(xì)菌群落存在著定量差異，并且隨著土壤類型的不同內(nèi)生菌群落之間表現(xiàn)出顯著的差異。此外，培養(yǎng)在3種不同類型土壤中的超積累生態(tài)型東南景天根內(nèi)細(xì)菌群落組成存在顯著差異（P＜0.01），且細(xì)菌群落的多樣性也隨著土壤類型的不同而發(fā)生一定的變化[26]。另一方面，土壤污染物濃度的不同也會(huì)影響超積累植物根部微生物群落組成，如種植在不同污染程度的鋅鎘復(fù)合污染土壤中的Arabidopsis halleri，相比于高濃度污染土壤，輕度污染土壤對(duì)根近距離α-變形菌綱和黃桿菌門細(xì)菌具有負(fù)面影響，而對(duì)γ-變形菌綱細(xì)菌有正向影響[38]，盡管該結(jié)果未涉及內(nèi)生細(xì)菌的變化，但是根際細(xì)菌作為植物內(nèi)生菌形成的來源，前者的變化勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致后者的改變。

綜上所述，重金屬超積累植物體內(nèi)定殖著的大量微生物類群大都具備抵抗重金屬脅迫的能力，近年來對(duì)超積累植物內(nèi)生微生物群落的研究已有不少報(bào)道。但是由于植物種類、植物組織中重金屬的濃度和宿主植物生長條件的不同所造成的巨大變異，以及這些研究中運(yùn)用的表面滅菌技術(shù)、培養(yǎng)基質(zhì)和分離微生物的方法也各不相同，因此很難對(duì)不同的研究進(jìn)行比較。

3 超積累植物內(nèi)生微生物對(duì)植物的促生作用機(jī)制

當(dāng)植物遭受重金屬污染脅迫時(shí)，微生物可以改變植物細(xì)胞的代謝活動(dòng)，協(xié)助植物耐受高濃度的重金屬脅迫，從而更好地適應(yīng)環(huán)境變化[36,39-40]。在重金屬污染土壤中，內(nèi)生微生物對(duì)植物的促生作用有助于提高植物修復(fù)效率[41-44]。大量研究表明，植物促生細(xì)菌（如磷酸鹽和鉀鹽溶解菌、游離固氮菌和根際細(xì)菌等）和真菌（如叢枝菌根真菌）能夠顯著地促進(jìn)植物生長。當(dāng)前研究認(rèn)為，微生物對(duì)植物的促生作用主要通過分泌生長素[如吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid,IAA）、細(xì)胞分裂素、赤霉素等]、ACC脫氨酶緩解乙烯脅迫、分泌鐵載體、螯合物和H+溶解難溶性礦質(zhì)養(yǎng)分來改善植物營養(yǎng)狀況、固氮作用和增加宿主植物對(duì)生物脅迫抗性等機(jī)制促進(jìn)植物生長（圖2）。

植物促生作用在植物提取或移除土壤重金屬元素過程中有著十分重要的意義，植物生物量的簡單增加會(huì)提高整株植物對(duì)重金屬元素的積累量。通過接種具有促生作用的植物內(nèi)生菌提高植物的生物量或產(chǎn)量，這在作物、木材植物和超積累植物中都有相關(guān)研究。如在土培試驗(yàn)中，在芥菜上接種一株能夠耐受Cr6+脅迫并分泌IAA的內(nèi)生假單胞菌（Pseudomonas sp.）PsA4后，顯著地提高了植物的生物量[45]。從鋅鎘超積累植物東南景天體內(nèi)分離的鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）SaMR12能夠分泌大量的IAA，顯著促進(jìn)植物的生長[32]。除了植物促生作用外，內(nèi)生菌還能通過ACC脫氨酶活性降低脅迫條件下植物體內(nèi)的乙烯水平，從而緩解植物受到的生物或非生物脅迫[46-47]。此外，微生物釋放的生長素（如IAA）還能夠進(jìn)一步增強(qiáng)ACC脫氨酶活性，因?yàn)樯L素能誘導(dǎo)植物體內(nèi)ACC合酶的生物合成，從而能增加ACC的生物合成[55]。同樣地，超積累植物內(nèi)生菌還能夠通過分泌鐵載體、螯合物、H+等代謝物活化土壤中難溶態(tài)微量元素（如Fe、Cu、Zn），改善植物的營養(yǎng)狀況[56]。一方面鐵載體可以與Fe3＋、Zn2+和 Cu2+結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)植物對(duì)該類微量元素的吸收，提高植物的養(yǎng)分狀況[57-58]。另一方面，鐵載體或其他螯合物與土壤重金屬形成胞外絡(luò)合物也可以提高植物對(duì)重金屬的耐受能力，并以此促進(jìn)植物的生長和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)[59]。另外，與植物共生的固氮菌，如慢生根瘤菌和中慢生根瘤菌通過固氮作用給植物供給氮素營養(yǎng)，促進(jìn)植物的生長[60]。WANI等[61]發(fā)現(xiàn)，給生長在鉻污染土壤中的鷹嘴豆接種能夠固氮的中慢生根瘤菌（Mesorhizobium）RC3后顯著地提高了植物的生物量和地上部氮含量。早期研究認(rèn)為超積累植物不是菌根共生植物，直到近期的研究發(fā)現(xiàn)才推翻了這種論斷。Berkheya coddii是第一種被發(fā)現(xiàn)的與叢枝菌根共生的Ni超積累植物[62]。形成菌根后的超積累植物Berkheya coddii生物量增加，最終地上部的Ni含量也相應(yīng)增加[63]。在此之后，許多種超積累植物都發(fā)現(xiàn)與叢枝菌根真菌形成共生體，并且叢枝菌根的定殖可以促進(jìn)植物生長及其對(duì)重金屬的耐性。除上述微生物促生機(jī)制以外，有益性細(xì)菌還可以通過產(chǎn)生鐵載體[64]、細(xì)胞壁裂解酶[65]和抗生素類代謝產(chǎn)物[66]，保護(hù)植物免受細(xì)菌、真菌或病毒性病原微生物的危害。例如，一些耐受金屬的植物促生菌釋放的幾丁質(zhì)酶、β-1，3葡聚糖酶、蛋白酶或脂肪酶，可以溶解真菌性病原菌，緩解植物遭受的病原菌危害[67]。需要指出的是，內(nèi)生微生物具有多重促生作用，只是通過接種該類微生物難以直接證明其特定的促生特性。此外，內(nèi)生微生物的促生效果還取決于植物種類、土壤性質(zhì)、微量元素濃度及利用的微生物種類和菌株類型。因此，如何定量描述內(nèi)生微生物的特定促生作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究。

表1 超積累植物內(nèi)生菌群落組成、代謝特征及對(duì)植物生長和金屬吸收累積的影響Table 1 Composition and metabolic features of endophytic bacterial population from hyperaccumulators and its effects on plant growth and metal accumulation

表1 （續(xù)） Continuation of Table 1

圖2 植物內(nèi)源促生菌促進(jìn)植物生長和重金屬的積累Fig.2 Plant endophytic microbes enhance plant growth and accumulation of heavy metal

4 超積累植物內(nèi)生微生物對(duì)重金屬活化和吸收的影響機(jī)制

內(nèi)生微生物不僅影響植物的生長，同時(shí)參與了超積累植物根際重金屬的活化和吸收[68]。當(dāng)前研究表明，內(nèi)生微生物釋放的代謝產(chǎn)物，如鐵載體、生物表面活性劑、有機(jī)酸和植物生長因子等可以直接或間接地影響植物對(duì)重金屬的吸收，即內(nèi)生微生物通過影響植物的生長動(dòng)態(tài)而間接地影響植物吸收和積累重金屬，而在根際土壤中通過酸化、螯合、沉降、活化或氧化-還原反應(yīng)直接地影響植物吸收和積累重金屬[9,41,56-57,69]。

超積累植物內(nèi)生菌和菌根共生體可以直接或間接地影響植物根系形態(tài)發(fā)育，改變根系對(duì)重金屬的吸收和接觸面積，最終影響植物對(duì)重金屬的吸收和積累。例如，從東南景天體內(nèi)分離的內(nèi)生菌Sphingomonas sp.SaMR12擁有強(qiáng)大的促生潛質(zhì)（分泌IAA和ACC脫氨酶活性），接種該內(nèi)生菌后，顯著地增加了東南景天的根長、根表面積和根毛數(shù)，最終提高了植物對(duì)重金屬的吸收和積累[32]。同樣地，給砷超積累植物蜈蚣草接種土著叢枝菌根真菌后，植物干質(zhì)量和砷（As）的吸收量都有所增加[70]。加拿大楊（Populus canadensis）與外生菌根真菌卷緣網(wǎng)褶菌共生后植物體內(nèi)的鎘積累顯著增加[71]。

此外，植物內(nèi)生菌通過分泌H+、有機(jī)酸、鐵載體和其他螯合物促進(jìn)難溶態(tài)重金屬的溶解，增加重金屬的生物有效性，并提高植物對(duì)重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力。如植物內(nèi)生固氮醋酸桿菌分泌的5-酮葡萄糖酸（5-ketogluconic acid）可以溶解土壤中的ZnO、ZnCO3或Zn3(PO4)2等不同來源的鋅（Zn），從而提高Zn的有效性[72]。從鎘超積累植物龍葵體內(nèi)分離出來的內(nèi)生菌Pseudomonas sp.Lk9能夠分泌酒石酸、蘋果酸、甲酸和檸檬酸等有機(jī)酸，接種該內(nèi)生菌后，根際土壤中有效態(tài)重金屬濃度增加，并且龍葵地上部的鎘（Cd）積累量也顯著提高[73]。除了有機(jī)酸，內(nèi)生菌分泌的鐵載體、重金屬螯合物、生物表明活性劑和胞外大分子等物質(zhì)也能夠活化難溶態(tài)重金屬，提高其生物有效性和移動(dòng)性。例如，從龍葵體內(nèi)分離出的4種內(nèi)生菌Serratia nematodiphila LRE07、Enterobacter aerogenes LRE17、Enterobacter sp.LSE04和Acinetobacter sp.LSE06都能分泌鐵載體，將其反接種到龍葵中后，明顯地增加了龍葵中Cd的積累量[36]。SHIN等[74]從赤楊皮樹體內(nèi)分離到一株可以產(chǎn)生鐵載體的芽孢桿菌（Bacillus sp.），給油菜接種該內(nèi)生菌后，油菜體內(nèi)的鉛（Pb）含量顯著增加。另外，微生物分泌的生物表面活性劑與重金屬在土壤界面通過絡(luò)合反應(yīng)，將重金屬從土壤基質(zhì)中解吸出來，提高土壤溶液中重金屬的溶解性和生物有效性，并增加植物對(duì)重金屬的積累量。SHENG等[75]向種植西紅柿的土壤中接種能產(chǎn)生生物表面活性劑的植物內(nèi)生芽孢桿菌（Bacillus sp.）J119后，有效地增加了西紅柿組織中Cd的積累量。此外，從鎘超積累植物龍葵體內(nèi)分離得到的假單胞菌（Pseudomonas sp.）Lk9能夠產(chǎn)生表面活性劑，將其反接種到龍葵體內(nèi)后，植物體內(nèi)的Cd積累量明顯增加[73]。

另外，一些與植物相關(guān)聯(lián)的微生物還可以通過重金屬氧化還原反應(yīng)改變重金屬的有效性，從而影響植物對(duì)重金屬的吸收和積累[76-77]。例如，在重金屬污染土壤中硫氧化細(xì)菌可以提高銅（Cu）的移動(dòng)性而促進(jìn)植物吸收Cu[78]，其主要機(jī)制是硫氧化菌在氧化硫的過程中降低了土壤pH，進(jìn)而提高了Cu的有效性。此外，從硒超積累植物體內(nèi)分離到的66種內(nèi)生菌，它們之中大多數(shù)可以將亞硒酸鹽還原成元素態(tài)硒[27]。從上述研究可以看出，盡管微生物分泌的各種代謝產(chǎn)物能有效地提高植物對(duì)重金屬的吸收積累，但是這些研究大都是以接種細(xì)菌菌株的方式間接地證明內(nèi)生微生物能夠促進(jìn)重金屬的活化及其在植物內(nèi)的吸收積累，缺乏相應(yīng)的直接證據(jù)；另外，這些研究都是在人工污染土壤中進(jìn)行的，還沒有在重金屬污染的大田中有關(guān)生物表面活性劑促進(jìn)植物吸收重金屬的研究。

5 超積累植物內(nèi)生微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

5.1 在強(qiáng)化植物修復(fù)中的應(yīng)用

超積累植物內(nèi)生微生物能夠耐受高濃度的重金屬，促進(jìn)植物的生長，提高植物生物量，增加植物對(duì)重金屬元素的吸收積累。因此，內(nèi)生微生物在重金屬污染土壤的植物提取修復(fù)中具有重要的應(yīng)用前景（表2）。土培試驗(yàn)表明，接種東南景天非致病內(nèi)生真菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）后，東南景天根系和地上部生物量顯著增加，礦山土和復(fù)合污染水稻土中重金屬的生物有效性顯著提高，東南景天對(duì)Zn、Cd和Pb提取效率顯著提高[79]。CHEN等[36]從鎘超積累植物龍葵體內(nèi)分離出了大量的有益內(nèi)生菌，在接種這些細(xì)菌后，龍葵的根、莖和葉中Cd、Zn和Pb的積累量顯著增加。HE等[49]從錳超積累植物伏毛蓼中分離出1株拉恩菌（Rahnella sp.JN6），采用盆栽試驗(yàn)種植油菜（Brassica napus）并接種該內(nèi)生菌后，發(fā)現(xiàn)其能夠大量地定殖在油菜組織內(nèi)部，顯著提高油菜地上部和根部的Cd、Pb和Zn含量。盧文顯[80]的研究表明，來自錳超積累植物商陸體內(nèi)的抗錳（Mn）細(xì)菌能夠促進(jìn)商陸的生長，提高M(jìn)n的去除能力。張淼[81]的研究發(fā)現(xiàn)，來自鉻富集植物李氏禾根部的內(nèi)生菌微桿菌屬（Microbacterium sp.）WHYN16能夠顯著提高李氏禾地上部鉻（Cr）含量，提高Cr的提取修復(fù)能力。需要指出的是，目前有關(guān)超積累植物內(nèi)生微生物在植物修復(fù)中的應(yīng)用還停留在試驗(yàn)階段，沒有大規(guī)模、商品化內(nèi)生菌劑的制備、生產(chǎn)和田間應(yīng)用。

5.2 在作物增產(chǎn)中的作用

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中利用超積累植物內(nèi)生微生物強(qiáng)大的促生功能來提高作物的產(chǎn)量具有重要的意義。油菜盆栽試驗(yàn)表明，接種從東南景天體內(nèi)篩選的內(nèi)生菌Sphingomonas sp.SaMR12后，油菜的生物量顯著增加[82]。在Cd和硝酸鹽復(fù)合污染土壤中種植歐洲油菜，接種東南景天內(nèi)生菌Acinetobacter calcoaceticus Sasm3后，油菜地上部生物量和籽粒產(chǎn)量均顯著增加，且地上部Cd的積累量增加，而NO3－積累量減少[83]。徐濤英[84]的研究表明，來自錳超累積植物商陸的內(nèi)生芽孢桿菌（Bacillus sp.）SLS18能夠促進(jìn)甜高粱（Sorghum bicolor L.）的生長，顯著提高其生物量。WANG等[85]的研究發(fā)現(xiàn)，接種從東南景天體內(nèi)篩選的內(nèi)生菌（Sphingomonas sp.SaMR12、Enterobacter SaCS20）72 h后，綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的內(nèi)生菌能成功定殖在水稻根系內(nèi)，并顯著促進(jìn)了水稻的生長，提高了籽粒產(chǎn)量。從上述研究可以看出，接種超積累植物內(nèi)生菌能夠提高其他農(nóng)作物的生物量，這與內(nèi)生微生物對(duì)植物的促生作用密不可分。然而，目前對(duì)超積累植物內(nèi)生微生物在大田作物促生機(jī)制的研究還不夠深入，大部分研究只是通過接種試驗(yàn)間接證明，缺少直接的試驗(yàn)證據(jù)。同時(shí)，關(guān)于超積累植物內(nèi)生微生物對(duì)土壤肥力狀況、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的影響研究還少有報(bào)道，對(duì)大田作物產(chǎn)量構(gòu)成因子、礦質(zhì)養(yǎng)分吸收的影響研究還未見報(bào)道。

5.3 在微量元素生物強(qiáng)化中的應(yīng)用

微量元素（如Fe、Mn、Ni或Zn）是人體所必需的營養(yǎng)元素，主要通過植物進(jìn)入人類食物鏈中。食用作物中礦質(zhì)元素的缺乏及人體對(duì)其較低的生物利用性，導(dǎo)致人體微量營養(yǎng)元素缺乏。因此，生物強(qiáng)化是改善人體微量元素營養(yǎng)的重要手段，而農(nóng)藝生物強(qiáng)化措施如接種有益內(nèi)生菌來促進(jìn)植物對(duì)微量元素的吸收積累，是實(shí)現(xiàn)微量元素生物強(qiáng)化的有效途徑之一。WANG等[85]研究了東南景天的5種內(nèi)生菌，Burkholderia SaZR4和 SaMR10、Sphingomonas sp.SaMR12、Variovorax SaNR1和 Enterobacter SaCS20對(duì)稻谷中Zn的生物強(qiáng)化作用，結(jié)果表明，在土培試驗(yàn)下接種SaMR12和SaCS20這2種內(nèi)生菌可以增加水稻籽粒中Zn的積累量。此外，HE等[49]從錳超積累植物伏毛蓼體內(nèi)分離出了一株能夠分泌IAA、鐵載體、具有ACC脫氨酶活性并且能夠溶解無機(jī)態(tài)磷酸鹽的內(nèi)生菌Rahnella sp.JN6，采用盆栽試驗(yàn)種植油菜，接種該內(nèi)生菌后顯著地促進(jìn)了油菜體內(nèi)Zn的積累量。上述報(bào)道中，盡管接種重金屬超積累植物內(nèi)生菌促進(jìn)了作物對(duì)微量元素的吸收積累，實(shí)現(xiàn)了微量元素的生物強(qiáng)化作用，但是這些研究都是在模擬條件下（土培或水培）獲得的結(jié)果，而在大田試驗(yàn)中接種同種微生物是否能夠獲得和模擬條件下類似的效果，有待于后續(xù)的深入研究。

表2 重金屬超積累植物內(nèi)生微生物提高植物修復(fù)效率及其在生物強(qiáng)化中的作用Table 2 Endophytic microbes derived from metal hyperaccumulators accelerating phytoremediation efficiency and their role in biofortification

表2 （續(xù)） Continuation of Table 2

6 研究展望

目前有關(guān)植物內(nèi)生微生物的研究主要集中在內(nèi)生微生物的篩選、生理活性物質(zhì)的分析等方面，且主要以牧草、草坪草等普通植物為主，有關(guān)重金屬超積累植物內(nèi)生微生物的研究不多，尤其是超積累植物內(nèi)生微生物的演替規(guī)律、與宿主植物的互作機(jī)制、內(nèi)生微生物菌劑的制備及其在植物修復(fù)中的應(yīng)用等方面還有待深入研究。

6.1 超積累植物內(nèi)生微生物演替規(guī)律

大量研究表明，植物內(nèi)生微生物群落組成受到土壤類型、宿主植物種類、生育期等因素的影響[92-94]。然而，目前有關(guān)重金屬超積累植物內(nèi)生微生物組裝特點(diǎn)及演替規(guī)律還不清楚，如超積累植物內(nèi)生微生物群落的組裝是否會(huì)隨著土壤類型、宿主植物種類的不同而發(fā)生變化，同種超積累植物內(nèi)生微生物在不同時(shí)間尺度（生育期、種植周期和年限）和不同空間尺度（根際空間，包括根內(nèi)、根表、根際和非根際）上的演替規(guī)律如何，演替后的內(nèi)生微生物群落是否會(huì)影響超積累植物的生長、重金屬的吸收積累和解毒等，都值得我們進(jìn)一步研究。此外，超積累植物內(nèi)生微生物種群特征和功能基因表達(dá)隨著植物種類、土壤類型和污染特征的不同而表現(xiàn)出的變異規(guī)律也值得深入研究。

6.2 超積累植物與內(nèi)生微生物的互作機(jī)制

內(nèi)生微生物普遍存在于植物組織內(nèi)，與宿主建立復(fù)雜的相互作用關(guān)系，并且存在不同的傳播方式（垂直和水平傳播）[95]。內(nèi)生微生物與植物的互作關(guān)系及對(duì)宿主代謝的影響是近年來熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一，而有關(guān)超積累植物與內(nèi)生微生物的互作機(jī)制理論目前還是空白。一方面，內(nèi)生微生物通過多種途徑來影響超積累植物對(duì)重金屬的吸收及生理功能，但這種生理功能的實(shí)現(xiàn)有賴于雙方獨(dú)特的調(diào)控機(jī)制，因此，超積累植物與內(nèi)生微生物雙方都進(jìn)化形成特有的分子調(diào)控機(jī)制來維持這種互惠共生關(guān)系，而這種相互識(shí)別、相互適應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制目前并不清楚。另一方面，內(nèi)生微生物影響超積累植物的信號(hào)系統(tǒng)途徑，內(nèi)生微生物代謝產(chǎn)物對(duì)植物重金屬吸收、積累和分布的影響，以及對(duì)植物重金屬超積累基因表達(dá)的影響等，都值得進(jìn)一步研究。

6.3 內(nèi)生微生物對(duì)土壤功能和微生態(tài)環(huán)境的影響

內(nèi)生微生物不僅能改變與其共生植物的生理和生長指標(biāo)，提高重金屬污染土壤中的植物修復(fù)效率，還可通過宿主植物間接對(duì)土壤的理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[96-97]。在植物修復(fù)過程中根際土壤重金屬的濃度逐漸降低，加上接種的內(nèi)生微生物在根際土壤中的定殖，都會(huì)影響宿主植物根系分泌物的組成和含量，改變土壤中有機(jī)物的輸入，影響土壤碳、氮含量及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而對(duì)土壤肥力狀況、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響[40,98]。因此，有必要研究植物修復(fù)前后與碳、氮和磷循環(huán)過程相關(guān)的微生物群落組成、功能基因表達(dá)及相關(guān)土壤酶活性的變化規(guī)律，揭示內(nèi)生微生物介導(dǎo)的植物修復(fù)過程如何影響重金屬污染土壤的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和微生態(tài)環(huán)境。

6.4 內(nèi)生微生物強(qiáng)化菌劑的制備及應(yīng)用

近年來，有關(guān)超積累植物內(nèi)生微生物提高重金屬污染土壤植物修復(fù)效率的報(bào)道不少，但絕大部分都是在實(shí)驗(yàn)室條件下獲得的結(jié)果，缺乏大田試驗(yàn)數(shù)據(jù)。要將內(nèi)生微生物應(yīng)用于大規(guī)模污染農(nóng)田植物修復(fù)，首先，要實(shí)現(xiàn)內(nèi)生微生物菌劑的規(guī)?；a(chǎn)，而構(gòu)建合適的載體，提高微生物菌劑生物活性至關(guān)重要，同時(shí)需要優(yōu)化內(nèi)生微生物菌劑的生產(chǎn)工藝，擴(kuò)大內(nèi)生微生物菌劑的生產(chǎn)量；其次，改善內(nèi)生微生物在田間土壤中的生存和定殖條件，如通過降低土壤中土著微生物活性或多樣性來提高內(nèi)生微生物的競爭力及清除可能抑制內(nèi)生微生物代謝活性的不利因素等，確保接種到田間土壤中的微生物能成功擴(kuò)增、繁殖并發(fā)揮作用；最后，需研究內(nèi)生微生物菌劑大田施用技術(shù)，包括施用劑量、施用時(shí)期等。

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