非生物脅迫下植物中CBL—CIPK信號通路研究進展

李洋 李曉薇 徐赫韓

摘 要：植物在外界脅迫環(huán)境中能夠生存得益于它們對脅迫的快速應(yīng)答和體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控機制。鈣調(diào)磷酸酶B樣蛋白（CBL）和CBL相互作用蛋白激酶（CIPK）信號通路是一類靈敏的Ca2+信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。在眾多植物中都已經(jīng)鑒定出了編碼CBL和CIPK的基因。本文將圍繞CBL/CIPK基因的表達模式和功能，非生物脅迫下植物CBL和CIPK調(diào)控網(wǎng)絡(luò)上最新的研究發(fā)現(xiàn)進行綜述，以期為抗逆育種提供新思路。

關(guān)鍵詞：鈣調(diào)磷酸酶B樣蛋白；CBL相互作用蛋白激酶；非生物脅迫；信號通路

中圖分類號：S-03 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20180631003

CBL-CIPK信號通路參與了高鹽、干旱、低溫，高PH和低鉀離子等非生物脅迫。類鈣調(diào)磷酸酶B樣蛋白（Calcineurin B like protein，CBL）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（CBL interacting protein kinase）都有大量的基因家族成員，每個成員編碼特定的上游或下游靶蛋白，從而使植物具有應(yīng)對外界脅迫的能力。對CBL和CIPK突變體的研究表明當(dāng)植物在遭受干旱、鹽堿、低溫、高溫的脅迫時CBL和CIPK對植物生長至關(guān)重要。許多CBL和CIPK已經(jīng)證明參與植物的離子運輸，它們限制了有毒離子輸送到組織，使植物最大程度地從土壤中吸收營養(yǎng)物質(zhì)。不同脅迫下CBL-CIPK系統(tǒng)的響應(yīng)具有多樣性，特異性和復(fù)雜性。

1 CBL與CIPK蛋白的結(jié)構(gòu)與功能特點

1.1 CBL蛋白結(jié)構(gòu)與功能特點

CBL蛋白最早在擬南芥中分離得到。該蛋白和動物體內(nèi)的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calcineurin B，CNB）及酵母中神經(jīng)元鈣感應(yīng)器（Neuronal Calcium Sensors ，NCS）的B亞基具有高度相似性[1]。CBL蛋白含有4個EF手性結(jié)構(gòu)（EF-hands），4個EF手性的間距是不變的，從EF1到EF4依次相距22，25和32個氨基酸距離[2]。每個EF手性結(jié)構(gòu)都含有負責(zé)與Ca2+結(jié)合的保守的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)[3]。環(huán)區(qū)域的特征是含有12個氨基酸殘基DKDGDGKIDFEE的共有序列[4]。1（X），3（Y），5（Z），7（-X），9（-Y）和12（-Z）位置的氨基酸負責(zé)與Ca2+結(jié)合。EF1在X和Y位置處插入2個氨基酸殘基。這些位置結(jié)構(gòu)的變化隨之產(chǎn)生與Ca2+結(jié)合的親和力變化[5]。CBL蛋白可以根據(jù)其N-末端結(jié)構(gòu)域進一步分為2個主要亞組。第1組由CBL1，CBL4，CBL5，CBL8和CBL9組成，N末端結(jié)構(gòu)域，含有43～48個氨基酸， N-末端發(fā)生豆蔻?；?。第2組由蛋白質(zhì)CBL2，CBL3，CBL6，CBL7和CBL10組成，具有延伸的N-末端結(jié)構(gòu)域，類似來自NCS組的K+通道互作蛋白（K+ Channel Interaction Proteins，KChIP），不含有可辨別的脂質(zhì)修飾基序。在第2個亞組CBL10具有非常長的N端結(jié)構(gòu)，延伸形成潛在的單跨膜結(jié)構(gòu)域，對CBL10的定位非常重要[6]。

1.2 CIPK蛋白結(jié)構(gòu)與功能特點

根據(jù)結(jié)構(gòu)特征CIPKs被歸類為蔗糖非發(fā)酵-1-相關(guān)激酶（Sucrose non-fermenting 1，SNF1 ）也稱為SnRK3蛋白。CIPK蛋白由2個結(jié)構(gòu)域組成：保守的N末端絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域，有可以磷酸化的激活環(huán)，激活環(huán)中氨基酸磷酸化使激酶激活，與其它植物蛋白激酶中發(fā)現(xiàn)的N末端激酶結(jié)構(gòu)域類似；FISL基序（也稱為NAF）和PPI基序組成的C末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，由高度保守的氨基酸Asn（N），Ala（A），Phe（F），Ile（I），Ser（S）和Leu（L）組成的NAF基序是結(jié)合CBL蛋白所必須的，NAF基序與CIPK的C末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域結(jié)合以覆蓋其激活環(huán)，而使激酶處于自身抑制狀態(tài)[7]。PPI基序是與磷酸酶相互作用的具有自我抑制作用。

2 CBL-CIPK途徑的分子機制

CBL-CIPK復(fù)合物在對外界脅迫中起非常重要的作用。CIPK蛋白通過磷酸化N末端保守的絲氨酸殘基來實現(xiàn)它們與CBL蛋白的相互作用，CIPK基因家族在擬南芥，水稻，玉米，和甘藍型油菜中都證實了這一功能[8]。CBL-CIPK途徑在調(diào)節(jié)鈉離子（Na+）[9]，鉀離子（K+），鎂離子（Mg2+），硝酸鹽離子（NO3-）和質(zhì)子（H+）穩(wěn)態(tài)，以及調(diào)節(jié)離子運輸系統(tǒng)方面也有重要作用[10]。

CBL和CIPK蛋白的結(jié)構(gòu)特征為它們的相互作用提供了基礎(chǔ)。CBL蛋白中EF手性排列的差異導(dǎo)致在脅迫下CBL-CIPK復(fù)合物對鈣親和力不同。鹽敏感（ Salt Overly Sensitive，SOS）途徑是第1個被鑒別出的CBL-CIPK網(wǎng)絡(luò)，包含SOS3 類類鈣調(diào)磷酸酶B蛋白CBL4和SOS2類蛋白激酶CIPK型激酶CIPK24。CBL4-CIPK24/S0S3-S0S2復(fù)合物定位到細胞膜上，激活Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白以增強耐鹽性[11]。CBL4通過其EF手性域附著Ca2+導(dǎo)致其活性發(fā)生改變[3]，有利于CBL4通過NAF基序與CIPK24相互結(jié)合。這種結(jié)合使CIPK24的構(gòu)象發(fā)生變化并暴露其激活，即CIPK24的自抑制狀態(tài)解除，活化的CIPK24磷酸化Na+/H+交換器從細胞中排出過量的Na+[12-15]。

3 不同植物中CBL-CIPK的研究

3.1 擬南芥中CBL-CIPK的研究

擬南芥中有26種CIPK，屬于SOS2類蛋白家族。CIPKs不能直接與鈣離子作用，需要CBL作為鈣傳感器以消除CIPKs中激酶的自抑制作用。與CIPK相互作用的CBL蛋白有10種，屬于SOS3類蛋白家族均定位在細胞膜或液泡膜上，推斷是因為細胞膜和液泡膜是重要的鈣貯存部位使CBL-CIPK復(fù)合物可以在不同脅迫下快速調(diào)節(jié)鈣離子濃度形成特定的網(wǎng)絡(luò)應(yīng)答系統(tǒng)，該網(wǎng)絡(luò)在擬南芥中調(diào)節(jié)鈣離子、鈉離子、鉀離子、硝酸根離子、磷酸根離子和ABA穿過細胞膜和液泡膜[16，18]。鈣離子在植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)和植物生長發(fā)育過程中是一個重要的信使。在擬南芥中已經(jīng)鑒定了4個主要的Ca2+傳感器，包括鈣依賴性蛋白激酶（Calcium-

dependent protein kinase，CDPK），鈣調(diào)磷酸酶B樣蛋白（Calcineurin B-like protein，CBL），鈣調(diào)蛋白（Calmodulin，CAM），蛋白樣蛋白（ Calmodulin-like，CML）[19，20]。

除了包含激酶結(jié)構(gòu)域的CDPK外，其他3種Ca2+傳感器沒有酶結(jié)構(gòu)域，這意味著它們在細胞信號傳導(dǎo)的下游起作用。

3.2 小麥中CBL-CIPK的研究

在植物中，CBL-CIPK信號通路在非生物脅迫中起關(guān)鍵作用。然而，由于小麥的六倍體性質(zhì)，所以在作為重要主食的小麥中對CBL-CIPK功能研究較少。小麥基因組中有4個CBL蛋白79個CIPK蛋白。鹽（NaCl）、H2O2、干旱（PEG）和冷（4℃）脅迫下，對小麥幼苗根和葉中2種TaCBLs和5種TaCIPKs的轉(zhuǎn)錄水平進行分析。TaCIPK31在ABA誘導(dǎo)的根中顯著上調(diào)，在鹽脅迫下，TaCIPK24在根和葉中上調(diào)，TaCBL9，TaCIPK7，TaCIPK15，TaCIPK24，和TaCIPK32由H2O2誘導(dǎo)。冷處理導(dǎo)致上調(diào)的基因數(shù)量最多，沒有基因在根或葉中被冷脅迫下調(diào)[21，22]。小麥的TaCIPK2基因，在聚乙二醇，脫落酸和H2O2處理的小麥葉片中上調(diào)表達。在滲透和干旱脅迫條件下，過表達TaCIPK2的轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出更高的耐旱性；轉(zhuǎn)TaCIPK2基因煙草植物的失水率和離子滲漏較低，丙二醛和過氧化氫含量較低[23]。以上結(jié)果表明，TaCIPK2在轉(zhuǎn)基因煙草的干旱脅迫中發(fā)揮了重要的作用。

3.3 大豆中CBL-CIPK的研究

大豆（ Glycine max ）作為人類生產(chǎn)生活中食用油和動物飼料中蛋白質(zhì)的重要來源，使它成為了最重要的豆類作物[24]。大豆全基因組測序已經(jīng)完成，但是基因組水平上對CBL-CIPK基因家族的表征鮮有報道，干旱脅迫下大豆CIPK基因家族包含52個基因（GmCIPK1至GmCIPK52）并分為4個亞組（I至IV）。對52個大豆CIPK家族基因表達模式的分析表明，大多數(shù)大豆CIPK基因內(nèi)含子是干旱誘導(dǎo)型的； 使用公開的Affymetrix微陣列數(shù)據(jù)庫分析CIPK基因的基因表達模式，在干旱的營養(yǎng)生長階段，發(fā)現(xiàn)20個基因被上調(diào)，葉中28個被下調(diào)。在生殖階段，在干旱脅迫下，葉片中發(fā)現(xiàn)有33個被上調(diào)，15個下調(diào)。在干旱發(fā)生階段，18個基因上調(diào)，13個基因在2個發(fā)育階段都顯示出不穩(wěn)定的下調(diào)。確認了18個CIPK基因是干旱誘導(dǎo)型[25]。

3.4 其他植物中CBL-CIPK的研究

植物應(yīng)對逆境脅迫有許多調(diào)控機制，近幾年來CBL-CIPK參與的植物生理功能研究越來越多。通過幾個全基因組的基因表達譜指出了各種蛋白基因家族的作用，為研究干旱脅迫機制提供了高效的數(shù)據(jù)[26]。表達分析表明，水稻中包括10個CBL和30個CIPK，它們不僅參與非生物脅迫，在生長發(fā)育過程中也發(fā)揮了重要作用。在水稻中通過OsCIPK23的過表達可以提高干旱相關(guān)基因的表達水平來改善水稻耐旱性[27]；有文獻表明棉花GhCIPK6被干旱、鹽和ABA誘導(dǎo)，干旱脅迫下對轉(zhuǎn)GhCIPK6的擬南芥進行RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)AtCBL1和AtCBL4表達水平增加，說明在脅迫下GhCIPK6與CBL共同參與信號傳導(dǎo)途徑，玉米的ZmCIPK21在鹽脅迫下表達上調(diào)，超表達玉米ZmCIPK21的擬南芥在鹽脅迫下脫水反應(yīng)性元件結(jié)合蛋白DREB1B和DREB1C基因上調(diào)，增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性；油菜籽中的CBL4在酵母雙雜交和雙分子熒光互補（BiFC）測定中證明與CIPK24相互作用，過表達油菜籽CBL4基因的擬南芥比野生型擬南芥具有更高耐鹽性。

4 展望

非生物脅迫下植物中CBL-CIPK信號通路會與多種逆境相關(guān)信號通路相互作用，如早期發(fā)現(xiàn)的低鉀離子響應(yīng)途徑，硝酸鹽傳感和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及ABA信號通路等。近期又發(fā)現(xiàn)了新的與CBL-CIPK相互作用的途徑，包括赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、氧氣匱乏通路、葡萄糖信號通路和ROS通路。由于CBL–CIPK網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，未來對于CBL–CIPK的研究應(yīng)該更趨于系統(tǒng)化，并運用現(xiàn)代的計算和實驗方法進行研究。組學(xué)（如轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的聯(lián)合分析）和生物信息學(xué)研究有助于闡明CBL–CIPK調(diào)控網(wǎng)絡(luò)演化的多樣性和各成員的功能。另外，對于CBL–CIPK各成員在不同植物中、不同的逆境脅迫中以及植物生長發(fā)育和形態(tài)建成過程中的相互作用，都應(yīng)該加強關(guān)注。

相信隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)和分子育種手段的成熟與完善，深入解析CBL-CIPK信號通路，有效放大和應(yīng)用各基因成員的功能，將在非生物脅迫方面為農(nóng)作物的抗性育種做出貢獻。

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作者簡介：李洋（1993-），女，碩士生在讀，研究方向：植物基因工程與抗逆分子生物學(xué)；李海燕（1971-），女，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：大豆等油料作物逆境生理與分子育種。