藠頭揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化及其GC-MS分析

吳琦，肖錦，魯雅清，郭一，劉陽，*

（1.湖北省生物多肽糖尿病藥物工程技術(shù)研究中心，生物多肽糖尿病藥物湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430223；2.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北武漢430073）

藠頭（Allium chinense G.don）為多年生草本百合科（Liliaceae Juss.）蔥屬（Alliaceae）植物，又名藠白頭、薤、野韭、野蒜、小根蒜，原產(chǎn)我國，廣泛分布于湖南、湖北、河北、山東、廣西、吉林、江蘇、安徽、遼寧、黑龍江等各省，日本、朝鮮、俄羅斯等其它國家也有種植[1]。藠頭鱗莖不僅富含糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、鈣、磷、鐵、鋅、銅、胡蘿卜素、維生素C等多種營養(yǎng)物質(zhì)[2]，還含有諸多兼具藥用價(jià)值的化合物，如有機(jī)硫化物、甾體皂苷、含氮化合物等[3]，為不可多得的藥食同源佳品。

研究表明，藠頭揮發(fā)油具有抗癌防癌、抗炎殺菌、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗動(dòng)脈粥樣硬化和血小板凝聚、增強(qiáng)免疫力、抗氧化等多種功效[4-5]。鑒于傳統(tǒng)揮發(fā)油提取方法產(chǎn)率低、原料損耗大，且國內(nèi)外對(duì)藠頭揮發(fā)油的提取工藝研究報(bào)道甚少，本試驗(yàn)以水為溶劑，設(shè)置超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比、蒸餾時(shí)間為單因素，考察其對(duì)藠頭揮發(fā)油提取率的影響，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化藠頭揮發(fā)油提取工藝，以期獲得高效、經(jīng)濟(jì)的提取條件，在此基礎(chǔ)上采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS） 法對(duì)所得藠頭揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)成分分析，為后續(xù)藠頭中活性成份的深入研究及藠頭資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮藠頭：產(chǎn)自湖南省湘潭；乙醚（AR）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

98-1-B型電子調(diào)溫電熱套：天津市泰斯特儀器有限公司；UPT-11-10T型超純水儀：成都超純科技有限公司；SB-3200DT型超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；2 000 mL揮發(fā)油提取器：四川蜀玻（集團(tuán)）有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藠頭揮發(fā)油的提取流程

新鮮藠頭→去皮稱重→搗碎→加純化水均漿→超聲（設(shè)置一定溫度）→水蒸氣蒸餾→沸騰時(shí)加乙醚萃取→收集揮發(fā)油→稱重→計(jì)算提取率[6]

揮發(fā)油提取率/%=提取的揮發(fā)油（g）/藠頭質(zhì)量（g）×100

1.2.2 單因素試驗(yàn)

選取超聲時(shí)間為 30 min，料液比為 1 ∶3（g/mL），蒸餾時(shí)間 2 h，分別對(duì)超聲溫度（15、25、35、45、55、65 ℃）進(jìn)行單因素試驗(yàn)；選取超聲溫度為25℃，料液比為1 ∶3（g/mL），蒸餾時(shí)間 2 h，分別對(duì)超聲時(shí)間（15、30、45、60、75、90 min）進(jìn)行單因素試驗(yàn)；選取超聲溫度為25℃，超聲時(shí)間為30 min，蒸餾時(shí)間2 h，分別對(duì)料液比[1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5、1 ∶6、1 ∶7（g/mL）]進(jìn)行單因素試驗(yàn)；選取超聲溫度為25℃，超聲時(shí)間為30 min，料液比為 1 ∶3（g/mL），分別對(duì)蒸餾時(shí)間（1、1.5、2、2.5、3、3.5 h）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用L9（43）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化藠頭揮發(fā)油提取工藝。

1.2.4 GC-MS分析

采用GC-MS對(duì)藠頭揮發(fā)油中化學(xué)成分分析。19091J-433HP-5色譜柱（5%Phenyl Methyl Siloxan，30 m×250 μm×0.25 μm）；柱溫：50℃（保持 1min，5℃/min升溫）→280℃（保持10 min）；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣流速：1 mL He·min；分流比 10 ∶1；進(jìn)樣量：1.0 μL。電子轟擊離子源，溫度230℃；四極桿溫度：150℃；接口溫度：280℃；電子能量：70 eV；電壓：1 976 V；掃描質(zhì)量范圍：30 am～500 amu；溶劑延遲：4 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲溫度對(duì)藠頭揮發(fā)油提取率的影響超聲溫度對(duì)提取率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 超聲溫度對(duì)藠頭揮發(fā)油提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate from Allium chinense

由圖1可知，在15℃～25℃之間時(shí)，藠頭揮發(fā)油提取率隨超聲溫度升高而升高，25℃時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)升高超聲溫度，揮發(fā)油提取率反而降低。原因可能是隨著溫度升高，藠頭中的蒜素酶活性逐漸增強(qiáng)，酶促反應(yīng)效率增強(qiáng)，至25℃時(shí)蒜素酶活性達(dá)到最大值，酶促反應(yīng)效率最高，揮發(fā)油提取率同時(shí)達(dá)到峰值，但隨著溫度持續(xù)升高，蒜素酶變性失活導(dǎo)致酶促反應(yīng)效率反而降低，揮發(fā)油提取率也隨之降低[7]；另一方面，隨著溫度的升高，超聲過程中浸出的小分子揮發(fā)油因沸點(diǎn)低不穩(wěn)定造成部分揮發(fā)，且攜帶著純水一定程度的損失，從而導(dǎo)致藠頭揮發(fā)油提取率整體下降[8]。因此超聲溫度控制在25℃時(shí)藠頭揮發(fā)油提取效率最高。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)藠頭揮發(fā)油提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)藠頭揮發(fā)油提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on extraction rate from Allium chinense

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間逐漸延長，藠頭中揮發(fā)油提取率隨之增大，并于30 min時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)延長超聲時(shí)間，提取率反而降低。原因可能是隨著超聲時(shí)間的延長，在超聲波的空化作用、機(jī)械振動(dòng)作用和熱效應(yīng)下，藠頭原料顆粒被粉碎的機(jī)會(huì)增大，細(xì)胞中的揮發(fā)油浸出越充分，增加了物質(zhì)的傳質(zhì)量，從而提取率也相應(yīng)增大[9]，但當(dāng)超聲時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，溶劑中揮發(fā)油濃度的繼續(xù)增加,使得藠頭中的揮發(fā)油溶解進(jìn)入純水中的速率逐漸減慢，最終達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[8]，同時(shí)伴隨一定程度揮發(fā)油的揮發(fā)損失，即揮發(fā)油提取率逐漸降低至基本持平。因此將超聲時(shí)間控制為30 min時(shí)提取效率最高。

2.1.3 料液比對(duì)藠頭揮發(fā)油提取率的影響

料液比對(duì)提取率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對(duì)藠頭揮發(fā)油提取率的影響Fig.3 Effect of ratios of water to material on extraction rate from Allium chinense

由圖3可知，隨著料液比的增加藠頭揮發(fā)油提取率逐漸增加，在料液比為1∶3（g/mL）時(shí)達(dá)到最高值，繼續(xù)增加料液比，提取率反而降低。原因可能是在料液比較低時(shí)，不能完全分散并浸沒藠頭原料，藠頭中揮發(fā)油不能充分接觸純水并釋放，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油提取受限，增加一定的料液比，純水的比例增加，使得細(xì)胞內(nèi)揮發(fā)油浸出更加均勻充分，藠頭揮發(fā)油提取率明顯增大，在1∶3（g/mL）時(shí)提取率達(dá)到峰值，隨后繼續(xù)增加料液比，純水占比過多，揮發(fā)油在水中濃度過高，蒸餾更易沸，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油揮發(fā)損失過多，不利于藠頭揮發(fā)油的提取[10]。因此控制料液比在1∶3（g/mL）時(shí)藠頭揮發(fā)油提取率最高。

2.1.4 蒸餾時(shí)間對(duì)藠頭揮發(fā)油提取率的影響

蒸餾時(shí)間對(duì)提取率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 蒸餾時(shí)間對(duì)藠頭揮發(fā)油提取率的影響Fig.4 Effect of distillation time on extraction rate from Allium chinense

如圖4所示，隨著蒸餾時(shí)間的延長，藠頭揮發(fā)油提取率顯著增大，于2 h時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)延長蒸餾時(shí)間提取率反而降低。原因可能是在前期增加蒸餾時(shí)間時(shí)，藠頭原料中的揮發(fā)油提取更加充分，繼續(xù)延長蒸餾時(shí)間，藠頭原料中揮發(fā)油已基本浸出完全，并且揮發(fā)油在純水中濃度基本飽和，蒸餾時(shí)間過長時(shí)，造成部分小分子揮發(fā)油一定程度揮發(fā)損失，不利于提高藠頭揮發(fā)油提取率[9]，因此控制蒸餾時(shí)間為2 h。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選取各因素的最佳水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表1 藠頭揮發(fā)油提取正交因素水平表Table 1 Extraction of volatile oil from Allium chinense by orthogonal factor level

表2 藠頭揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of volatile oil extraction from Allium chinense

續(xù)表2 藠頭揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Orthogonal test results of volatile oil extraction from Allium chinense

由表2可知，各因素對(duì)提取率影響的大小順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞超聲溫度＞蒸餾時(shí)間＞料液比。由K值得出藠頭揮發(fā)油提取的最佳工藝為A1B2C2D2，即超聲時(shí)間30 min，超聲溫度15℃，蒸餾時(shí)間2 h，料液比為1 ∶3（g/mL）。

2.2.2 放大驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of verification test

由表3可知，藠頭揮發(fā)油的平均提取率為0.035 6%，大于正交試驗(yàn)中最大提取率0.032 2%，收集的藠頭揮發(fā)油為特殊芳香性氣味的淡黃色油狀液體。

2.2.3 化學(xué)成分分析

藠頭揮發(fā)油用色譜二氯甲烷按1∶2（體積比）稀釋，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)的總離子流圖見圖5。采用峰面積歸一化法從總離子流圖計(jì)算出各成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并利用NIST11.LIB標(biāo)準(zhǔn)庫進(jìn)行成分分析，結(jié)果見表4。

圖5 藠頭揮發(fā)油總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of Allium chinense volatile oil

表4 藠頭揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果Table 4 GC-MS results of Allium chinense volatile oil

續(xù)表4 藠頭揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果Continue table 4 GC-MS results of Allium chinense volatile oil

由表4可知，從該法提取的藠頭揮發(fā)油中鑒定了19種成分，主要為含硫化合物（33.83%）和烷烴類化合物（58.17%）。其中，含硫化合物8種，含量最高的為二甲基三硫，占揮發(fā)油總量的23.12%，高于文獻(xiàn)[11]中采用水蒸氣蒸餾、石油醚收集的結(jié)果，其次還檢出烯丙基甲基硫醚（5.06%）、二甲基四硫醚（2.24%）、1，3-二噻烷（1.55%）、烯丙基甲基二硫（1.04%）、2，5-二甲基噻二唑（0.42%）等含硫化合物；以及烷烴類化合物8種，含量最高的為正二十烷，占揮發(fā)油總量的14.86%，其次還檢出正二十四烷（14.12%）、正十六烷（11.1%）、正二十七烷（9.33%）、二十九烷（5.53%）等。

3 結(jié)論與討論

目前常用的揮發(fā)油提取方法有水蒸氣蒸餾法、超聲波法、微波法、溶劑法、壓榨法、超臨界流體萃取法等，其中水蒸汽蒸餾法以純水為溶劑，設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、可操作性強(qiáng)[12]，是《中國藥典》中揮發(fā)油含量測(cè)定指定選用方法，且在工業(yè)化批量生產(chǎn)中運(yùn)用廣泛；超聲波提取法是利用超聲波自身的空化作用、機(jī)械作用和熱效應(yīng)達(dá)到增強(qiáng)分子間傳輸作用的目的，從而提高提取率，具有省時(shí)高效的特點(diǎn)[13]。本試驗(yàn)采用超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取藠頭揮發(fā)油，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，得到最佳的提取條件為：超聲時(shí)間為15min，超聲溫度為25℃，蒸餾時(shí)間2 h，料液比為1∶3（g/mL），此條件下的平均提取率為0.035 6%，該結(jié)果低于文獻(xiàn)[14]采用蒸氣蒸餾、石油醚收集的0.1%的提取率，可能的原因是：（1）藠頭中的蒜素酶活性會(huì)隨溫度變化而變化，酶促反應(yīng)速率會(huì)在一定程度上影響揮發(fā)油提取率；（2）總揮發(fā)油中含有的部分小分子揮發(fā)油沸點(diǎn)較低，提取過程中隨著溫度升高會(huì)造成藠頭揮發(fā)油的損失；（3）小分子揮發(fā)油在揮發(fā)損失的過程中會(huì)帶出部分純水，伴隨著溶劑一定程度的損失；（4）此試驗(yàn)水蒸氣蒸餾未采用循環(huán)水提取，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油浸入純水中會(huì)產(chǎn)生一定程度的飽和，導(dǎo)致提取率會(huì)低于理論值。

藠頭揮發(fā)油具有特殊性芳香氣味，其主要成分為含硫化合物，如二甲基三硫醚、甲基烯丙基二硫化合物、二丙基二硫醚化合物等[15]；除此之外藠頭揮發(fā)油中還含有噻吩類化合物、烷烴類化合物等[16]，具有極大的生產(chǎn)價(jià)值和市場(chǎng)開發(fā)潛力。本試驗(yàn)采用GC-MS鑒定出19種化合物，其中二甲基三硫占揮發(fā)油總量的23.12%，高于彭軍鵬等人采用水蒸氣蒸餾、石油醚收集后二甲基三硫的含量（19.82%）[14，17]；同時(shí)也檢測(cè)出硫醚類化合物如烯丙基甲基硫醚和二甲基四硫醚等。Kameoka等對(duì)日本產(chǎn)地藠頭揮發(fā)油的成分分析出主要揮發(fā)物為二丙基二硫，占揮發(fā)油總量的30.6%，此外他們還檢出了三硫雜環(huán)戊烷（Trithiolane）[18]，這些研究結(jié)果表明，藠頭中揮發(fā)油所含的硫化物成分因產(chǎn)地差異而不盡相同。藠頭揮發(fā)油的提取工藝研究與化學(xué)成分為其它領(lǐng)域的研究提供理論基礎(chǔ)。