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    酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性及穩(wěn)定性研究

    2018-11-09 05:37:04戴梓茹農(nóng)月睿黃巧張晨曉李瑩覃楨杰
    食品研究與開發(fā) 2018年22期
    關(guān)鍵詞:楊桃原液發(fā)酵液

    戴梓茹,農(nóng)月睿,黃巧,張晨曉,李瑩,覃楨杰

    (1.廣西高校北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點實驗室,廣西欽州535011;2.欽州學(xué)院食品工程學(xué)院,廣西欽州535011)

    酸楊桃是楊桃的一種,偏酸味,種植于熱帶亞熱帶地區(qū),四季帶果,產(chǎn)量大,營養(yǎng)豐富,具有生津止渴、保肝、降糖等功用[1-4]。目前對于楊桃的研究和加工多是甜味品種的楊桃,包括果樹培育、保鮮、果汁加工等[5-10]。而酸楊桃味道較酸,人們甚少鮮食。酸楊桃發(fā)酵液是兩廣地區(qū)人們用鹽制浸泡自然發(fā)酵的方法制備的傳統(tǒng)地方性日用飲料,對腸胃熱、咽喉痛、牙痛、消炎降火等具有特別的調(diào)理功效,浸泡后的果實可用作烹調(diào)調(diào)味料、日常小零食等。由于酸楊桃發(fā)酵液口感偏酸咸,其特殊功效缺乏科學(xué)數(shù)據(jù)支持,致使酸楊桃發(fā)酵飲料難以推廣。本研究采用牛津杯法測定了酸楊桃發(fā)酵液對李斯特菌、大腸桿菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌5種供試菌的抑菌活性,同時以原液稀釋液為樣本,確定其最小抑菌濃度,并對酸楊桃發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)進行了初步研究,為酸楊桃的精深加工和產(chǎn)品推廣提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    酸楊桃:采集于廣西博白;氫氧化鈉(分析純):江西景泰設(shè)備有限公司;鹽酸(分析純):成都市科龍化工股份有限公司;氯化鈉(分析純):廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心;營養(yǎng)瓊脂(生物試劑)、細菌學(xué)蛋白胨(生物試劑)、牛肉浸膏(生物試劑)、瓊脂粉(生物試劑):山東梁山科鑫生物制品有限公司;胰蛋白酶(5 000 U/g):國藥集團化學(xué)試劑有限公司;酸性蛋白酶(50 000 U/g)、中性蛋白酶(50 000 U/g)、堿性蛋白酶(50 000 U/g):南寧市東恒華道生物科技有限公司;李斯特菌(G+)、大腸桿菌(G-)、大腸桿菌 O157(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)、蠟樣芽孢桿菌(G+):由欽州學(xué)院北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點實驗室提供。

    1.2 儀器與設(shè)備

    HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋:江蘇金怡儀器科技有限公司;SO510C立式壓力蒸汽滅菌器:重慶雅馬拓科技有限公司;BCD-575WDBI立式冰箱:青島海爾股份有限公司;Medium超純水機:上海和泰儀器有限公司;LHS-150HC-II恒溫恒濕箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;C20-HK2002E多功能電磁爐:廣東美的生活電器制造有限公司;GZX-DH.500-BS型電熱恒溫干燥箱:上海躍進醫(yī)療器械有限公司;B型玻璃儀器氣流烘干器:鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;ME204E/02電子天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;PHS-3EpH計:上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;SW-CJ-2FD潔凈工作臺:蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

    1.3 酸楊桃發(fā)酵液制備

    1)樣品準(zhǔn)備:按照比例(960 mL無菌水,400 g酸楊桃,50 g食鹽)將各種原材料及配料加入滅菌的發(fā)酵罐中,發(fā)酵3周,將酸楊桃發(fā)酵液取出,過濾,得到酸楊桃發(fā)酵液原液,并用無菌水稀釋成不同的濃度梯度,冷藏于無菌離心管中,備用。

    2)食鹽水對照:按比例(960 mL無菌水,50 g食鹽)保存3周后,其余操作同(1),獲得5%食鹽水對照。

    1.4 酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性研究

    1.4.1 菌種活化及菌液制備

    1.4.1.1 培養(yǎng)基

    營養(yǎng)肉湯:牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水 1 000 mL,pH 7.2~7.4。

    營養(yǎng)瓊脂:牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水 1 000 mL,pH 7.2~7.4,瓊脂 17 g。

    2%水瓊脂:20 g瓊脂粉加入1 000 mL水中,加熱溶化后,于121℃滅菌15 min。

    1.4.1.2 菌液制備

    菌種傳代培養(yǎng):取適量菌種,接種到試管固體斜面培養(yǎng)基中,置于37℃培養(yǎng)24 h,室溫放置4 h,置于4℃冰箱保存。

    供試菌菌懸液制備:挑取單一菌落接種到液體培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)12 h,以1%的接種量傳代培養(yǎng)一次后,用生理鹽水(0.85%)進行10倍梯度稀釋,選取10-3倍稀釋液為試驗用的菌懸液。

    1.4.2 酸楊桃發(fā)酵液抑菌試驗

    選取牛津杯法測定酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性。在平板中加入10 mL水瓊脂,待其凝固后,用鑷子將滅菌后的牛津杯置于素瓊脂上(每個平板可放置4個牛津杯)。將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂冷卻到40℃,以2%的接種量加入菌懸液,混勻后倒約25 mL于水瓊脂層上(注意不要倒入牛津杯小孔中),待其凝固后,在一個牛津杯小孔中加入0.2 mL的對照溶液(無菌水或5%食鹽水),其余3個牛津杯小孔中加入0.2 mL的酸楊桃發(fā)酵液樣品。在37℃下正置培養(yǎng)24 h后,觀察是否有抑菌圈出現(xiàn),若出現(xiàn)抑菌圈,再用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

    1.5 酸楊桃發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性研究

    1.5.1 pH值對酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性的影響

    測定得知酸楊桃發(fā)酵液pH值為1.8,按照步驟配制以下溶液:1)配制與酸楊桃發(fā)酵液pH值相同的鹽酸溶液25mL;2)分別取10mL的酸楊桃發(fā)酵液于50mL的燒杯中,向燒杯加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為3、4、5、6、7。將以上溶液與酸楊桃發(fā)酵液原液作為試驗組,以濃度為5%的食鹽水作為對照組進行試驗,探討pH值對酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性的影響。

    1.5.2 溫度對酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性的影響

    取3支試管分別加入10 mL酸楊桃發(fā)酵液,將3支試管分別置于40、60、100℃的水浴鍋中水浴加熱1 h~4 h。將3個溫度處理的鹽制酸楊桃溶液作為試驗組,未經(jīng)處理的酸楊桃發(fā)酵液原溶液作為空白對照進行抑菌試驗。

    1.5.3 酶處理對酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性的影響

    取3個250 mL的燒杯分別向其中加入100 mL的酸楊桃發(fā)酵液溶液,再分別向3個燒杯中加入楊桃水質(zhì)量0.1%~0.2%的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶3種酶液,然后將3個燒杯置于50℃的水浴鍋中水浴加熱4 h,95℃下水浴加熱滅酶15 min。將處理過的樣本作為試驗組,未經(jīng)處理的酸楊桃發(fā)酵液原溶液作為空白對照進行抑菌試驗。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酸楊桃發(fā)酵液對5種供試菌的抑菌活性

    酸楊桃發(fā)酵液對5種指示菌的抑制作用及其最小抑菌濃度結(jié)果見表1。

    表1 酸楊桃發(fā)酵液對5種供試菌的抑菌活性Table 1 Bacteriostatic activity of sour carambola fermentation liquid with five bacteria

    由表1可知,酸楊桃發(fā)酵液對李斯特菌、大腸桿菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌均有良好的抑菌作用,抑菌圈直徑分別達到20.06、23.79、25.19、22.21、21.66 mm,最小抑菌濃度分別為 9、15、15、12、12 倍原液稀釋液。

    2.2 pH值對酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性的影響

    測定得知酸楊桃發(fā)酵液原液的pH值為1.8。試驗選擇金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為供試菌,以濃度為5%的食鹽水和與pH值為1.8的鹽酸作為對照,依次測定pH值調(diào)至3、4、5、6、7的酸楊桃發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用,結(jié)果見表2。

    由表2可知,隨著pH值的升高,酸楊桃發(fā)酵液抑菌效果逐漸降低,當(dāng)pH≥6時,抑菌作用消失。濃度為5%的食鹽水及pH值為6的酸楊桃汁兩者沒有抑菌作用。pH1.8的鹽酸對兩種指示菌具有抑制作用,但其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為12.77、12.30 mm,明顯小于酸楊桃發(fā)酵液抑菌圈直徑。因此,可知酸楊桃發(fā)酵液在較強酸性環(huán)境中的抑菌效果較好,堿性條件下,抑菌作用逐漸減弱甚至抑菌活性消失,這與雪松松針提取物、甜葉菊廢渣提取物的抑菌穩(wěn)定性研究結(jié)果一致[11-12],分析原因,可能是堿性環(huán)境導(dǎo)致酸楊桃發(fā)酵液的抑菌活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而使抑菌效果減弱或消失。

    表2 pH值對酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性的影響Table 2 Effect of bacteriostatic activity of sour carambola fermentation liquid by pH

    2.3 溫度處理對酸楊桃發(fā)酵液抑菌效果的影響

    以大腸桿菌為指示菌,酸楊桃發(fā)酵液原液為對照,置于40、60、100℃水浴處理1 h~4 h的酸楊桃發(fā)酵液為試驗樣本,檢測其抑菌效果,結(jié)果見表3。

    表3 溫度處理對酸楊桃發(fā)酵液抑菌效果的影響Table 3 Effect of bacteriostatic activity of sour carambola fermentation liquid by temperature

    由表3可知,不同處理溫度和不同處理時間處理過的酸楊桃發(fā)酵液之間抑菌作用沒有顯著變化,且與酸楊桃汁發(fā)酵液原液的抑菌效果無顯著性差異。因此,可以推斷酸楊桃發(fā)酵液的抑菌活性物質(zhì)具有良好的耐熱性。

    2.4 酶處理對酸楊桃發(fā)酵液抑菌效果的影響

    以大腸桿菌為指示菌,酸楊桃發(fā)酵液原液為對照,酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶處理的酸楊桃發(fā)酵液為試驗樣本,檢測其抑菌活性,結(jié)果見圖1。

    圖1 酶處理對酸楊桃發(fā)酵液抑菌效果的影響Fig.1 Effect of bacteriostatic activity of sour carambola fermentation liquid by enzyme

    如圖1所示,3種蛋白酶處理后,抑菌圈直徑分別為23.17、23.88、23.53 mm,酶處理后的酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性與酸楊桃發(fā)酵原液的抑菌活性無顯著差異,由此可推斷,酸楊桃發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)是非蛋白類物質(zhì)。

    3 結(jié)論

    本文采用牛津杯法測定了酸楊桃發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性,同時確定了對不同指示菌的最小抑菌濃度,并通過研究pH值、溫度以及酶處理對抑菌活性的影響,初步確定了酸楊桃發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)的特性。研究表明酸楊桃發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌都有良好的抑菌活性,抑菌圈直徑分別為 20.06、23.49、25.19、22.50、21.56 mm,最小抑菌濃度分別為酸楊桃發(fā)酵液原液9倍~15倍稀釋液。酸楊桃發(fā)酵液隨pH值升高,抑菌活性逐漸降低,當(dāng)pH>6時抑菌活性消失,溫度及蛋白酶對酸楊桃發(fā)酵液的抑菌效果沒有顯著影響,可以推斷酸楊桃發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)可能是一類耐高溫的非蛋白類的酸性物質(zhì)。因此,將酸楊桃發(fā)酵液作為酸性環(huán)境下的具有良好耐熱性的非蛋白類天然防腐劑具有廣闊的前景。本研究主要對酸楊桃發(fā)酵液的抑菌作用及抑菌性質(zhì)作了部分基礎(chǔ)性的研究,研究工作還不夠透徹和全面,還存在一些尚待改進的工作。后續(xù)研究可對酸楊桃發(fā)酵液中的抑菌成分進行分離鑒定,并通過體內(nèi)動物實驗進一步闡明其抑菌機制,為酸楊桃多功能開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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