• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    苦蕎黃酮醇合酶基因FtFLS4的克隆及其在大腸桿菌的表達

    2018-11-09 07:22:14李青青張潤敏石冠藍姚攀鋒王曉麗李成磊
    四川農(nóng)業(yè)大學學報 2018年5期
    關鍵詞:黃酮醇合酶苦蕎

    李青青,張潤敏,石冠藍,姚攀鋒,王曉麗,李成磊

    (四川農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,四川雅安 625014)

    黃酮類化合物是一類廣泛存在與植物中的多酚類次級代謝產(chǎn)物,主要包括黃酮、黃酮醇和花青素等幾大類。其中,黃酮醇化合物所占比例最大,約1/3左右,達2 000余種[1]。研究表明,黃酮醇不僅在植物中具有抵御紫外線傷害、抗寒抗旱、提高花粉萌發(fā)、促進花粉管發(fā)育等作用[2-6],在醫(yī)藥方面也具有多種功效如抗氧化抗衰老、抗炎、降糖降脂等[7-12]。

    黃酮醇合酶(flavonol synthase,F(xiàn)LS,EC 1.14.11.23)是植物黃酮醇生物合成的關鍵酶,屬于α-ODD家族黃酮醇合酶,催化二氫黃酮醇C3位發(fā)生羥基化生成黃酮醇[4]。1985年L.Britsch等[13]首先從受輻射的歐芹體外細胞提取物中檢測到二氫黃酮醇轉變?yōu)辄S酮醇;1993年T.A.Hoton等[14]首次從矮牽牛中分離得到FLS編碼基因,隨后在馬鈴薯、金魚草等物種中也分離得到FLS基因[15-16];這些研究表明,F(xiàn)LS由多拷貝基因編碼且在不同植物中拷貝數(shù)不同,其表達量和底物偏愛性等與黃酮醇含量和分布等密切相關[17-20]。A.Fujita等[21]從葡萄中分離出5個VvFLS同源基因,VvFLS1-5在花中均有表達,VvFLS2、VvFLS4和VvFLS5在果皮也有表達,但只有VvFLS4能影響黃酮醇的合成。M.Mahajan等[22]研究發(fā)現(xiàn)在煙草中FLS基因轉錄后沉默不僅導致黃烷-3-醇含量升高、花青素含量降低,同時也導致煙草開花延遲、結實率嚴重下降。由此可見,F(xiàn)LS不僅直接影響黃酮醇的合成,對其他黃酮類化合物的積累以及植物某些生理特征也有很重要的影響[23]。

    苦蕎(Fagopyrum tataricum)學名韃靼蕎麥,是一種藥食兩用小雜糧[24]。其生物活性成分主要為黃酮類化合物,其中屬于黃酮醇類的蘆丁含量最高,約占總黃酮的80%[25]。由于苦蕎食品和保健品日益受到廣大消費者的青睞,使得苦蕎黃酮代謝研究也成為植物次生代謝的熱點之一。目前,苦蕎黃酮醇合酶的同源基因FtFLS1、FtFLS2和FtFLS3已被克隆,且對其抗非生物脅迫及酶學性質進行了分析,表明這些基因的表達特征和酶學特征都有所不同[26-27]。隨著苦蕎轉錄組和基因組數(shù)據(jù)的日益豐富,可能會有更多的黃酮醇合酶同源基因被發(fā)現(xiàn)。本研究基于苦蕎花期轉錄組,篩選獲得一條注釋為黃酮醇合酶的新基因序列FtFLS4,通過RT-PCR技術克隆該基因,并采用生物信息學分析其編碼蛋白的分子特征,構建其重組原核表達載體實現(xiàn)在大腸桿菌中的表達,進而采用薄層層析技術對其表達產(chǎn)物的催化活性進行了初步鑒定。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    苦蕎(“西蕎二號”)種植于四川省雅安市四川農(nóng)業(yè)大學實驗基地。大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)和原核表達載體pET-30b(+)由本實驗室保存,其他藥品為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 基因克隆

    通過對苦蕎轉錄組數(shù)據(jù)的篩選,成功獲得5條含有完整ORF框的FtFLS基因,其cDNA序列長度均為1 000 bp左右。其中FtFLS1-3基因已被成功克隆[27],剩余2條FtFLS基因其中一條基因表達量在各組織中明顯高于另一條,為鑒定其功能并進一步研究苦蕎黃酮醇合酶,對該基因進行克隆并命名為FtFLS4。

    采用改良SDS法[28]提取苦蕎花期總DNA。采用RNAout試劑盒(天澤基因工程有限公司)提取苦蕎花期總RNA,以其為模板通過Revert AidTM First Strand Cdna Synthesis Kit逆轉錄試劑盒(Fermentas公司)制備cDNA第一鏈。根據(jù)苦蕎轉錄組設計引物(見表1)。以花期苦蕎cDNA及總DNA為模板,進行PCR反應。PCR反應體系(25 μL):cDNA模板1 μL,上下游引物各 1.5 μL,高保真 DNA 聚合酶(Prime STAR HS Polymerase,TaKaRa)12.5 μL 及無菌去離子水8.5 μL。反應條件:98℃預變性1 min;98℃變性10 s,58℃退火30 s,72℃延伸 30 s,30個循環(huán);72℃延伸10 min。按照DNAA-Tailing Kit試劑盒說明書對回收產(chǎn)物進行加A后克隆到pMD 19-T Simple Vector,篩選陽性轉化子測序。

    1.2.2 生物信息學分析

    利用DNAman 8.0拼接測序結果,分析苦蕎FtFLS4基因內(nèi)含子和外顯子,并推導其氨基酸序列。利用Clustal X對FtFLS4基因編碼蛋白進行多重序列比對,從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下載其他植物黃酮醇合酶序列,采用MEGA5.0軟件根據(jù)鄰接法,重復1 000次構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。采用SOMPA預測氨基酸序列二級結構,并使用ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)在線軟件對其進行分子量及等電點預測。利用蛋白質建模軟件SWISS-Model建立蛋白質模型,并使用Discovery Studio 2.5對接程序將FtFLS4蛋白模型與3種底物進行分子對接,底物的三維結構由chEBI(http://www.ebi.ac.uk/chebi/init.do)數(shù)據(jù)庫下載[二氫槲皮素(ChEBI:17948)、二氫山奈酚(ChEBI:15404)和二氫楊梅素(ChEBI:28429)]。

    表1 基因克隆及表達載體引物序列Table 1 Primers used for gene cloning and expression vector

    1.2.3FtFLS4基因的原核表達及蛋白純化

    以含F(xiàn)tFLS4基因的T載體質粒為模板,用引入酶切位點的引物(見表1)進行PCR反應,將擴增產(chǎn)物克隆到原核表達載體pET-30b(+)。將pET-30b(+)-FtFLS4重組質粒轉化大腸桿菌菌株E.coliBL21(DE3),挑取單菌落接種到10 mL液體LB培養(yǎng)基中(含卡那霉素)37℃過夜培養(yǎng)。按2%接種量接種于50 mL液體LB培養(yǎng)基(含卡那霉素),37℃培養(yǎng)至OD600=0.6~0.8,加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.4 mmol/L,22℃誘導6 h。收集菌體后按照His標簽蛋白純化試劑盒His-Tagged Protein Purification Kit(康為世紀生物科技有限公司)的操作步驟進行蛋白分離純化。

    1.2.4 重組FtFLS4的催化活性鑒定

    采用薄層層析技術(TLC)對酶的活性進行定性分析。參照Li C.[7]的方法,反應體系(總體積500 μL)中包括100 μmol/L底物(二氫槲皮素、二氫山奈酚、二氫楊梅素),111 mmol/L 乙酸鈉,83 μmol/Lα-酮戊二酸,42 μmol/L 硫酸鐵,2.5 mmol/L 維生素 C(pH 5.0),約 12.5 μg純化蛋白,37℃反應 20 min后用等體積乙酸乙酯萃取,進行薄層層析定性分析。依照中國藥典進行TLC檢測[29],以二氫黃酮醇、黃酮醇及兩者混合物為對照,將反應萃取物點樣于羧甲基纖維素鈉硅膠G薄層板上,以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=5∶2∶2為展層劑進行展層,碘蒸氣顯色并計算各斑點的Rf值。

    采用分光光度法對酶的活性進行定量分析。將不同質量濃度(0.5、1、2、3、5、7、9、12 和 15 μg/mL)的槲皮素、山奈酚和楊梅素溶于反應緩沖液中,利用紫外可見分光光度計(Shimadz,Japan)測得其吸光度并以此建立標準曲線。將酶促反應液于對應波長測定吸光度,根據(jù)標準曲線計算產(chǎn)物生成量進而計算比活力。酶活力單位采用國際酶單位(IU),即每分鐘生成1 μmol產(chǎn)物。

    2 結果與分析

    2.1 FtFLS4基因的克隆及序列分析

    以苦蕎花期總cDNA及DNA為模板,用引物FtFLS4f和FtFLS4r進行PCR擴增后分別獲得1條約1 000 bp的特異條帶。測序結果顯示,獲得的擴增產(chǎn)物分別為1 026 bp和1 126 bp。序列分析表明,苦蕎FtFLS4cDNA序列包含1個1 026 bp的ORF,編碼341個氨基酸殘基;DNA序列為1 126 bp,外顯子與cDNA序列一致,包含1個100 bp的內(nèi)含子,其序列符合GT-AG剪接規(guī)則(見圖1)。

    圖1 苦蕎FtFLS4的基因結構Figure 1 Gene structures of FtFLS4 of tartary buckwheat

    Protparam在線軟件預測推導的FtFLS4蛋白理論分子量大小為39.2 kDa,等電點(pI)為5.79。二級結構預測結果表明,F(xiàn)tFLS4主要由α-螺旋(36.95%)、β-轉角(6.74%)、β-片層(22.58%)以及無規(guī)則卷曲(33.72%)組成。將苦蕎FtFLS4的氨基酸序列與苦蕎其他4條FtFLS序列(FtFLS1:GenBank ID AEC33116.1,F(xiàn)tFLS2:GenBank ID AGE13752.1)及甜蕎(GenBank ID:AEC33115.1)、金蕎(GenBank ID:AHN19765.1)、擬南芥(GenBank ID:CAP09052.1)、葡萄(GenBank ID:BAE75810.1)和草莓(GenBank ID:ABH07784.1)的FLS序列進行多重序列比對,見圖2。結果顯示,F(xiàn)tFLS4具有α-ODD家族保守功能區(qū)域[30](conserved domain A和conserved domain B)及Fe2+和α-酮戊二酸結合位點。系統(tǒng)進化樹構建結果顯示,該進化樹主要聚為3簇:第I簇由苦蕎FtFLS1、FtFLS3及甜蕎、金蕎、荷蘭芹等雙子葉植物FLS聚成,Li C.等[7]研究表明FtFLS1在三級結構N-末端含有第1個α-螺旋,具有酶催活性;第Ⅱ簇由擬南芥AtFLS1-6及紫羅蘭和裸莖條果芥FLS聚成,均屬十字花科植物,其中AtFLS1-6中僅有AtFLS1和AtFLS3具有酶催活性,其他4個因三級結構N-末端缺失第1個α-螺旋而喪失活性[17];第Ⅲ簇由苦蕎FtFLS2、FtFLS4及裸子植物銀杏、單子葉植物玉米和大麥、雙子葉植物茶樹和葡萄的FLS聚成,研究表明玉米ZmFLS在三級結構N-末端也含有第1個α-螺旋且具有酶催活性[19]。本研究中苦蕎FtFLS4與玉米親緣關系最近,表明其可能具有相似的功能;此外與苦蕎其他FLS雖來源于同一物種,但卻處于不同的兩大簇,進化上出現(xiàn)了分化,推測其酶催活性等功能可能存在差異。

    圖2 苦蕎FtFLS4編碼蛋白的多重序列比對Figure 2 Amino acid sequence alignment of tartary buckwheat FtFLS4 with FLSs in others plants

    圖3 不同植物FLS氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Figure 3 Phylogenetic tree based on amino acid sequence encoded by FLS gene in different plant species

    2.2 FtFLS4編碼蛋白模型及分子對接

    利用蛋白質建模軟件SWISS-MODEL,以擬南芥無色花青素雙加氧酶(leucoanthocyanidin dioxygenase,LDOX)結晶結構為模板建立FtFLS4的蛋白模型,并將蛋白模型與3種二氫黃酮醇進行分子對接(見圖4)。FtFLS4為球狀蛋白,其底物結合位點位于蛋白質表面且主要由短序列的α-螺旋和無規(guī)則卷曲形成活性中心口袋,其中His215、Asp217和His272為Fe2+離子結合位點,Arg282和Ser284為α-酮戊二酸結合位點。在FtFLS4-DHQ模型中,Gln219和Gln196與二氫槲皮素分子形成氫鍵;FtFLS4-DHK模型中,Asp217、Gln219和Gln196與二氫山奈酚分子形成氫鍵;FtFLS4-DHM 模型中,Thr216、Arg194、Gln219和 Gln196與二氫楊梅素分子形成氫鍵。Gln219、Tyr218、His215、Arg194和 Phe288等氨基酸殘基提供疏水性環(huán)境和電子拉鏈以穩(wěn)定酶促反應微環(huán)境。分子對接結果顯示FtFLS4通過活性中心的氨基酸殘基可與3種二氫黃酮醇形成酶-底物復合物,推測該蛋白可能具有酶催活性。

    圖4 苦蕎FtFLS4的同源建模及分子對接Figure 4 The homology modeling and molecular docking of FtFLS4

    2.3 FtFLS4基因在大腸桿菌中的表達

    含有pET-30b(+)-FtFLS4重組質粒的大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導后,對表達蛋白產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析,見圖5。結果表明,誘導后的基因工程菌可見一條約40 kDa的新生帶,與理論相對分子質量一致。重組蛋白主要以可溶狀態(tài)表達,且表達量隨誘導時間逐漸增加。表達蛋白經(jīng)His-tag親和層析純化后獲得了條帶單一的融合表達酶蛋白,可用于后續(xù)酶催活性鑒定。

    2.4 FtFLS4表達蛋白的酶催活性鑒定

    采用薄層層析法對FtFLS4表達蛋白酶促反應產(chǎn)物進行鑒定(見圖6)。FtFLS4的酶促反應液樣品均在接近黃酮醇標準品(槲皮素、楊梅素和山奈酚)的位置新出現(xiàn)一個斑點。二氫槲皮素和槲皮素標準品Rf值分別為0.16和0.27;二氫楊梅素和楊梅素標準品Rf值分別為0.11和0.18;二氫山奈酚和山奈酚標準品Rf值分別為0.28和0.37。而FtFLS4的3種酶促反應液中兩種物質的Rf值均與標準品接近。結果表明,F(xiàn)tFLS4具有催化3種二氫黃酮醇轉化為黃酮醇的催化活性。此外,酶學活性測定表明,重組FtFLS4蛋白以二氫槲皮素、二氫山奈酚和二氫楊梅素為底物,其比活力分別為25.19×10-3、48×10-3和 19.04×10-3IU/mg。

    圖5 FtFLS4在大腸桿菌中的表達分析Figure 5 SDS-PAGE analysis of FtFLS4 expressed in E.coli

    圖6 苦蕎黃酮醇合酶FtFLS4酶催活性的薄層層析鑒定Figure 6 Activity identification for tartary buckwheat FtFLS4 with thin layer chromatography

    3 討論與結論

    黃酮醇合酶是黃酮類化合物代謝途徑的關鍵酶,其催化二氫黃酮醇生成黃酮醇,對植物黃酮醇和花青素的合成及積累都有重要影響[14]。FLS屬于α-同戊二酸依賴性雙加氧酶(α-oxoglutaratedependent dioxygenase,α-ODD)家族的成員,該家族還包括黃酮類化合物合成途徑的黃烷酮-3-羥化酶(flavanone-3-hydroxylase,F(xiàn)3H)、黃酮合酶(flavone synthase,F(xiàn)NS)和花青素合酶(anthocyanidin synthase,ANS)[31]。研究表明,α-ODD 基因都含有 2 個高度保守的功能區(qū)域,及α-酮戊二酸和Fe2+結合位點(Arg-X-Ser,His-Asp-His),推測可能與酶生物活性相關[32]。本研究所得FtFLS4含有α-ODD中2個高度保守的結構域和相關活性位點(His215、Asp217和His272為 Fe2+離子結合位點,Arg282和 Ser284為α-酮戊二酸結合位點)。因此,從分子結構上推測,F(xiàn)tFLS4可能具有黃酮醇合酶應具有的催化功能。同時,F(xiàn)tFLS4與3種二氫黃酮醇的分子對接分析結果也進一步支持上述推測。

    植物FLS屬于多拷貝基因,例如擬南芥有6個拷貝,玉米有 3 個拷貝,柑橘有 5 個拷貝[17,19,32]。已有研究表明,苦蕎FtFLS基因也存在多拷貝[33],并已分離克隆了3個FtFLS同源基因[27]。不同拷貝之間編碼的氨基酸序列上雖有著較高相似性,但三維結構卻存在差異,這些差異最終導致彼此之間有著不同的酶學活性及催化特征。擬南芥FLS基因的6個拷貝中,僅有AtFLS1和AtFLS3編碼蛋白具有催化活性,其他4個拷貝由于三級結構N-末端第一個α-螺旋缺失導致其活性喪失。其中,AtFLS1能有效催化擬南芥中黃酮醇的合成,而AtFLS3有著寬松的底物選擇性[17]。柑橘CuFLS[31]都趨向于催化二氫山奈酚,而玉米ZmFLS1[19]卻更加偏愛二氫槲皮素。本研究表明,苦蕎FtFLS1與FtFLS3與同屬蓼科植物的金蕎和甜蕎,親緣性最近,F(xiàn)tFLS2與雙子葉植物葡萄和茶樹親緣關系最近,而FtFLS4與單子葉植物玉米和大麥親緣性最近,說明苦蕎FtFLS同源基因在進化過程中出現(xiàn)分化,其編碼蛋白的催化活性和底物特異性可能存在差異。盡管通過大腸桿菌表達的苦蕎FtFLS1-4對3種二氫黃酮醇均表現(xiàn)出催化活性,但FtFLS1和FtFLS2對二氫槲皮素具有底物偏愛性,而FtFLS3和FtFLS4則更偏愛二氫山奈酚[27]??梢?,苦蕎中的黃酮醇合酶基因及其編碼蛋白在進化和功能上具有多樣性。

    目前,苦蕎基因組測序已經(jīng)完成[34],這使得在基因組尺度上的黃酮合酶基因進化分析和功能鑒定成為可能,可望進一步加深對苦蕎黃酮醇合成、調控及其對發(fā)育和抗逆生理的理解。

    猜你喜歡
    黃酮醇合酶苦蕎
    黃酮醇在果樹中的功能的研究進展
    河北果樹(2021年4期)2021-12-02 01:14:34
    四種中藥單體選擇性抑制環(huán)氧合酶-2活性的評價
    苦蕎花
    青年歌聲(2018年5期)2018-10-29 03:18:40
    芍藥黃色花瓣中黃酮醇及其糖苷類化合物組成分析
    UPLC法同時測定香椿芽中8種黃酮醇苷
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:37
    苦蕎殼和苦蕎籽中總黃酮的提取及含量比較
    廣東飼料(2016年3期)2016-12-01 03:43:12
    城門苦蕎
    廣西產(chǎn)黃杞葉不同溶媒提取物中二氫黃酮醇的定量分析
    苦蕎黃酮的純化及抗氧化活性的研究
    尋常型銀屑病皮損組織環(huán)氧合酶2(COX-2)的表達研究
    久久九九热精品免费| 9191精品国产免费久久| 亚洲国产欧美一区二区综合| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 黄片小视频在线播放| 亚洲成人免费电影在线观看 | 国产有黄有色有爽视频| 国产视频一区二区在线看| 欧美黑人精品巨大| 中文字幕av电影在线播放| 99久久精品国产亚洲精品| 一区二区av电影网| 老司机影院毛片| 欧美av亚洲av综合av国产av| 美女中出高潮动态图| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久热这里只有精品99| tube8黄色片| xxxhd国产人妻xxx| 日韩人妻精品一区2区三区| 人妻一区二区av| 欧美av亚洲av综合av国产av| 黄色a级毛片大全视频| 日本色播在线视频| 亚洲七黄色美女视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| h视频一区二区三区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 一区二区三区激情视频| 国产成人a∨麻豆精品| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品人妻久久久影院| 日本a在线网址| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲国产av新网站| 亚洲精品自拍成人| 嫁个100分男人电影在线观看 | 亚洲精品日本国产第一区| 在现免费观看毛片| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 久久毛片免费看一区二区三区| 人妻一区二区av| 国产成人一区二区在线| 看十八女毛片水多多多| 国产老妇伦熟女老妇高清| 在线观看免费午夜福利视频| 男女下面插进去视频免费观看| 1024视频免费在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 香蕉国产在线看| 精品福利永久在线观看| 欧美黑人精品巨大| 在线精品无人区一区二区三| 国产成人精品在线电影| 国产精品.久久久| 免费高清在线观看日韩| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 男男h啪啪无遮挡| 99久久综合免费| 老司机亚洲免费影院| 久久久精品区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影小说| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲第一青青草原| 国产不卡av网站在线观看| 午夜两性在线视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品一区二区在线不卡| 桃花免费在线播放| 亚洲熟女精品中文字幕| 女警被强在线播放| 亚洲人成电影免费在线| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产在线视频一区二区| 人妻 亚洲 视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 999精品在线视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲第一av免费看| 少妇精品久久久久久久| 美女午夜性视频免费| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲国产日韩一区二区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 天堂8中文在线网| 人妻人人澡人人爽人人| 久久久久国产精品人妻一区二区| 三上悠亚av全集在线观看| 曰老女人黄片| 高清欧美精品videossex| 秋霞在线观看毛片| 久久久久视频综合| 国产97色在线日韩免费| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美激情高清一区二区三区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 又紧又爽又黄一区二区| 午夜精品国产一区二区电影| 免费黄频网站在线观看国产| 久热爱精品视频在线9| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产日韩欧美在线精品| 日韩电影二区| 亚洲av综合色区一区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 丁香六月欧美| av在线播放精品| 亚洲五月色婷婷综合| 一个人免费看片子| 丝袜喷水一区| 自线自在国产av| av视频免费观看在线观看| 91成人精品电影| 国产在线一区二区三区精| 免费黄频网站在线观看国产| 999久久久国产精品视频| 中文字幕亚洲精品专区| 国产精品久久久人人做人人爽| videosex国产| 人体艺术视频欧美日本| 超色免费av| 麻豆国产av国片精品| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲五月色婷婷综合| 久久久久久久国产电影| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲人成网站在线观看播放| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| av国产久精品久网站免费入址| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 免费日韩欧美在线观看| 黄色 视频免费看| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 母亲3免费完整高清在线观看| 女警被强在线播放| 国产高清videossex| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲精品在线美女| 亚洲图色成人| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 搡老乐熟女国产| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲国产av影院在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 精品第一国产精品| 中文字幕色久视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产色视频综合| 国产一区二区三区av在线| 成人黄色视频免费在线看| 国产一区二区三区av在线| 男人操女人黄网站| 欧美日韩一级在线毛片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久性视频一级片| 91国产中文字幕| 两人在一起打扑克的视频| 成人国语在线视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 青春草视频在线免费观看| 熟女av电影| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产一级毛片在线| 精品一品国产午夜福利视频| 久久久国产精品麻豆| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久狼人影院| 欧美 日韩 精品 国产| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 日韩制服骚丝袜av| 老司机午夜十八禁免费视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产日韩欧美视频二区| 精品视频人人做人人爽| 欧美人与善性xxx| kizo精华| 欧美在线黄色| 两人在一起打扑克的视频| 91国产中文字幕| 久久性视频一级片| videosex国产| 黄片小视频在线播放| 欧美日韩综合久久久久久| 欧美精品一区二区免费开放| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品国产三级国产专区5o| 99热全是精品| 亚洲伊人色综图| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲九九香蕉| 国产一区二区三区av在线| 国产视频首页在线观看| 欧美日韩av久久| 国产爽快片一区二区三区| 乱人伦中国视频| 免费在线观看完整版高清| 日本a在线网址| 只有这里有精品99| 91麻豆av在线| 好男人视频免费观看在线| 超碰成人久久| 老司机在亚洲福利影院| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 国产成人免费无遮挡视频| 欧美久久黑人一区二区| 午夜免费鲁丝| 亚洲国产精品成人久久小说| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 黄片小视频在线播放| 黑丝袜美女国产一区| 日本a在线网址| 免费人妻精品一区二区三区视频| 七月丁香在线播放| 美女福利国产在线| 午夜免费成人在线视频| 国产精品.久久久| 亚洲天堂av无毛| 久久久久久久精品精品| 久久久久网色| 晚上一个人看的免费电影| 久久久精品免费免费高清| a级毛片在线看网站| 亚洲综合色网址| 一级黄片播放器| 人妻 亚洲 视频| 久久久久久久久久久久大奶| 久久99精品国语久久久| 亚洲一区二区三区欧美精品| 操出白浆在线播放| 黄片播放在线免费| 亚洲成人免费电影在线观看 | 大码成人一级视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产高清videossex| 一区二区三区四区激情视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲人成77777在线视频| 精品免费久久久久久久清纯 | 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| cao死你这个sao货| 国产国语露脸激情在线看| 欧美国产精品一级二级三级| 在线观看免费高清a一片| 国产精品一区二区精品视频观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 精品视频人人做人人爽| 女性生殖器流出的白浆| 又大又爽又粗| 美女主播在线视频| 亚洲成国产人片在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 自线自在国产av| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 人人妻人人澡人人看| 午夜久久久在线观看| 搡老乐熟女国产| 丝袜脚勾引网站| 久久人人97超碰香蕉20202| 在线天堂中文资源库| 国产极品粉嫩免费观看在线| 91精品国产国语对白视频| 自线自在国产av| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 在线 av 中文字幕| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 亚洲色图综合在线观看| 成人国产一区最新在线观看 | 七月丁香在线播放| 国产亚洲欧美精品永久| 丁香六月欧美| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产高清不卡午夜福利| 99热网站在线观看| 青青草视频在线视频观看| 国产免费视频播放在线视频| av不卡在线播放| 欧美av亚洲av综合av国产av| 天天操日日干夜夜撸| www.精华液| 日韩一区二区三区影片| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 精品国产乱码久久久久久小说| 成人国产av品久久久| 午夜激情av网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产一区二区激情短视频 | 色精品久久人妻99蜜桃| 高潮久久久久久久久久久不卡| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品 国内视频| 国产激情久久老熟女| 9热在线视频观看99| 无遮挡黄片免费观看| 人体艺术视频欧美日本| 中文字幕色久视频| 秋霞在线观看毛片| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲国产精品999| 后天国语完整版免费观看| 午夜久久久在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 丰满少妇做爰视频| 国产在线观看jvid| 视频在线观看一区二区三区| 两个人看的免费小视频| 晚上一个人看的免费电影| 两个人免费观看高清视频| 欧美激情高清一区二区三区| 黄色片一级片一级黄色片| 91精品伊人久久大香线蕉| 无遮挡黄片免费观看| 欧美在线一区亚洲| 久久午夜综合久久蜜桃| 三上悠亚av全集在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲人成电影观看| 一区二区三区四区激情视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 一区福利在线观看| 成人免费观看视频高清| 久久性视频一级片| 亚洲成人手机| 欧美97在线视频| 一区二区三区精品91| 黄色怎么调成土黄色| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产淫语在线视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 免费看不卡的av| 美女大奶头黄色视频| 国产激情久久老熟女| 曰老女人黄片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美xxⅹ黑人| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 好男人视频免费观看在线| 老熟女久久久| 国产精品一区二区在线观看99| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产精品一区二区免费欧美 | 老司机亚洲免费影院| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品二区激情视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 高清欧美精品videossex| 少妇被粗大的猛进出69影院| 免费看十八禁软件| 首页视频小说图片口味搜索 | 亚洲成人国产一区在线观看 | 9热在线视频观看99| 亚洲,欧美,日韩| 日本vs欧美在线观看视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 操出白浆在线播放| 亚洲av片天天在线观看| 国产淫语在线视频| 99精品久久久久人妻精品| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲精品一二三| 操美女的视频在线观看| 少妇 在线观看| 五月开心婷婷网| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 午夜福利视频精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 操美女的视频在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产午夜精品一二区理论片| 香蕉国产在线看| 久久 成人 亚洲| 精品人妻1区二区| 欧美xxⅹ黑人| 国产激情久久老熟女| 狂野欧美激情性bbbbbb| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美成狂野欧美在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 老司机影院毛片| 婷婷丁香在线五月| 久久国产精品影院| 久久亚洲国产成人精品v| 男人操女人黄网站| 亚洲国产最新在线播放| 精品国产一区二区三区四区第35| 一区在线观看完整版| 99九九在线精品视频| 美女午夜性视频免费| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久久久精品国产欧美久久久 | 国产男人的电影天堂91| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲第一青青草原| 亚洲人成电影免费在线| 最近手机中文字幕大全| 久久亚洲精品不卡| 十八禁人妻一区二区| 免费在线观看日本一区| 亚洲伊人色综图| 男的添女的下面高潮视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 18禁观看日本| 日本a在线网址| svipshipincom国产片| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲人成77777在线视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲国产日韩一区二区| 桃花免费在线播放| 国产精品99久久99久久久不卡| 精品少妇黑人巨大在线播放| 黄色片一级片一级黄色片| 免费日韩欧美在线观看| 黄色一级大片看看| 一级毛片 在线播放| 久热爱精品视频在线9| 国产三级黄色录像| 亚洲综合色网址| 妹子高潮喷水视频| 人体艺术视频欧美日本| svipshipincom国产片| 午夜精品国产一区二区电影| 国产成人精品久久久久久| 欧美大码av| 男女午夜视频在线观看| 国产黄色免费在线视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品高清国产在线一区| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 日本欧美国产在线视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 桃花免费在线播放| 国产精品国产三级国产专区5o| 午夜福利免费观看在线| 亚洲欧洲日产国产| 999久久久国产精品视频| 男女下面插进去视频免费观看| 精品少妇久久久久久888优播| 美女午夜性视频免费| 波多野结衣一区麻豆| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲,欧美,日韩| 中文字幕色久视频| 蜜桃国产av成人99| 国产成人精品久久二区二区91| 脱女人内裤的视频| 两个人免费观看高清视频| 人人妻人人澡人人看| 欧美日韩精品网址| 国产一区二区激情短视频 | 国产成人免费观看mmmm| 一边摸一边做爽爽视频免费| 午夜福利免费观看在线| 免费av中文字幕在线| 老熟女久久久| 又大又爽又粗| 最近手机中文字幕大全| 亚洲第一青青草原| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲精品成人av观看孕妇| 香蕉丝袜av| 久久久久久久精品精品| 99久久人妻综合| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美人与性动交α欧美软件| 十八禁网站网址无遮挡| 美女扒开内裤让男人捅视频| 99久久人妻综合| 国产精品成人在线| 手机成人av网站| 国产精品九九99| 成人影院久久| 国产免费又黄又爽又色| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久久久国产精品人妻一区二区| 最近中文字幕2019免费版| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲av成人精品一二三区| 日韩一区二区三区影片| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 91精品国产国语对白视频| 国产不卡av网站在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| www.自偷自拍.com| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 一本久久精品| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品一区在线观看国产| 赤兔流量卡办理| 成人影院久久| 黄片小视频在线播放| 久久影院123| 欧美激情 高清一区二区三区| 精品欧美一区二区三区在线| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产色视频综合| 女性被躁到高潮视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 热99久久久久精品小说推荐| xxx大片免费视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 青草久久国产| 黄色视频在线播放观看不卡| 精品国产乱码久久久久久男人| 男男h啪啪无遮挡| 高清视频免费观看一区二区| 国产精品欧美亚洲77777| 少妇精品久久久久久久| 亚洲av成人精品一二三区| 激情视频va一区二区三区| 欧美在线一区亚洲| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产在视频线精品| 亚洲成色77777| 一区二区三区四区激情视频| 深夜精品福利| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 性少妇av在线| 18禁观看日本| 视频区图区小说| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲五月色婷婷综合| 日韩av不卡免费在线播放| a级毛片黄视频| 国产成人精品在线电影| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 免费在线观看完整版高清| 国产成人a∨麻豆精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 手机成人av网站| 久久99一区二区三区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 天天添夜夜摸| 国产老妇伦熟女老妇高清| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 大香蕉久久成人网| 亚洲三区欧美一区| 久久九九热精品免费| 激情视频va一区二区三区| 免费观看a级毛片全部| 飞空精品影院首页| 免费在线观看黄色视频的| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲人成电影免费在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品一区蜜桃| 国产精品亚洲av一区麻豆| 在线观看一区二区三区激情| 777米奇影视久久| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 精品国产一区二区三区四区第35| 成人三级做爰电影| 国产av一区二区精品久久| 国产男人的电影天堂91| 精品一品国产午夜福利视频| 男女边吃奶边做爰视频| 18禁国产床啪视频网站| 久久久久久久久免费视频了| 在线天堂中文资源库| 精品少妇内射三级| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 免费观看av网站的网址| 亚洲国产精品成人久久小说| 日韩人妻精品一区2区三区| 午夜两性在线视频| 大香蕉久久成人网| 另类精品久久| 99精品久久久久人妻精品| 久久久久久久大尺度免费视频| 观看av在线不卡| www.自偷自拍.com| 精品久久蜜臀av无| h视频一区二区三区| 久久综合国产亚洲精品| 国产三级黄色录像|