趙順先，關(guān)統(tǒng)偉，向慧平，張國棟，張習(xí)超，歐夢瑩，林宜錦，王鵬昊

（西華大學(xué)微生物研究所/食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610039）

干奶酪是一種營養(yǎng)價(jià)值極高的奶制品，新疆本地人稱“酸奶疙瘩”。其工藝大致可以歸為原料、殺菌、接菌發(fā)酵、后熟、分離乳清、干燥成型等步驟。干奶酪根據(jù)其水分的含量可以分為特硬質(zhì)干奶酪、硬質(zhì)干奶酪、半硬質(zhì)干奶酪、半軟質(zhì)干奶酪和軟質(zhì)干奶酪[1]。干奶酪中含有豐富的乳酸菌，膳食干奶酪可以預(yù)防齲齒、強(qiáng)健骨骼、減少慢性疾病的發(fā)生[1-2]。乳酸菌（Lactic acid bacteria）是個(gè)種類繁多的微生物集體，目前包括Lactobacillus、Bifidobacterium、Pediococcus、乳球菌屬（Lactococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、Weissella、肉食桿菌屬（Carnobacterium）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、鏈球菌屬（Streptococcus）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、氣球菌屬（Aerococcus）、漫游球菌屬（Vagococcus）等 43 個(gè)屬，而且每年都有新的種屬被不斷分離和發(fā)現(xiàn)[3]。乳酸菌能賦予食品柔和的酸味和香氣，改善食品的品質(zhì)和營養(yǎng)[4]。還具有降低膽固醇、防止乳糖不耐受癥、止腹瀉、抗腫瘤、抗變異原、增強(qiáng)免疫力、清除自由基和延緩衰老等重要功能[5-6]。乳酸菌代謝產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可延緩食品腐敗、延長食品貨架期，被認(rèn)為是最適合的食品天然防腐劑[7]。

高通量測序技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的核心技術(shù)之一，它實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對幾百萬DNA分子測序的可能性，達(dá)到鑒定微生物的單一基因或全基因組的目的。高通量測序通常是指具有代表性的454焦磷酸測序技術(shù)（Roche公司）、Solexa技術(shù)（Illumina公司）和SOLiD技術(shù)（ABI公司）[8]，是環(huán)境微生物群落組成和多樣性研究的主流方法。目前，國內(nèi)基于高通量測序探索干奶酪中乳酸菌多樣性的研究并不多，本實(shí)驗(yàn)16S rDNA測序采用Illumina公司的Hiseq測序技術(shù)平臺，具有高通量、高精度、極佳重現(xiàn)性和測序成本低等優(yōu)點(diǎn)，從而很好的探測新疆傳統(tǒng)干奶酪中乳酸菌的多樣性，為區(qū)域性特色乳酸菌資源的挖掘提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

干奶酪樣品取自新疆庫爾勒、額敏、烏魯木齊、伊犁4個(gè)地區(qū)，每個(gè)地區(qū)隨機(jī)選擇3個(gè)地點(diǎn)取樣。樣品X1、X2和X3采集自庫爾勒，樣品X4、X5和X6采集自額敏，樣品X7、X8和X9采集自烏魯木齊，樣品X10、X11和X12采集自伊犁，采集到的樣品用真空包裝袋密封儲藏運(yùn)輸。本研究采集的12份新疆不同地區(qū)的干奶酪，其水分都在25%以下，屬于特硬質(zhì)干奶酪，其制作方法大致相同。

1.2 主要試劑與儀器

DNeasy PowerSoil試劑盒，Qiagen 公司；Omega凝膠提取試劑盒，Omega Bio-Tek公司；DNA PCRFree樣品制備試劑盒，TruSeq公司；Hiseq Rapid SBS Kit v2測序試劑盒，Illumina公司；硫酸鉀、硫酸銅、硫酸、硝酸、濃鹽酸等試劑均為分析純，成都市科龍化工試劑公司；

Qubit@2.0，Thermo Scientific；NanoDrop 分光光度計(jì)，Thermo Scientific；Applied Biosystems? Gene Amp? PCR System 9700，ABI公司；SH420 石墨消解儀、K1100自動(dòng)凱氏定氮儀、S402廢棄吸收系統(tǒng)，海能儀器有限公司；AA6880型原子分光光度計(jì)，日本島津公司；100 g多功能粉碎機(jī)，上海市蒲恒信息科技有限公司；可調(diào)式電熱板，武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司；PHS-3C pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 理化指標(biāo)檢測方法

干奶酪粉碎，過400目篩、混勻，保存?zhèn)溆谩?/p>

蛋白質(zhì)測定，參照GB 5009.5-2016，利用K1100自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行（氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)為6.38）。水分含量，參照GB 5009.3-2016檢測干奶酪中的水分含量。鈣含量，參照GB 5009.92-2016，利用AA6880型原子分光光度計(jì)測定。脂肪，參照GB 5009.6-2016，利用SOX406脂肪測定儀檢測。酸度，參照GB 5009.239-2016對干奶酪中的酸度進(jìn)行測定。pH的測定，稱取10 g干奶酪粉末，加入100 mL新煮沸冷卻至室溫的水，靜置30 min，使用pH計(jì)進(jìn)行測定。

1.4 樣品總DNA的提取和PCR擴(kuò)增

使用DNeasy PowerSoil試劑盒提取樣品中總DNA，用NanoDrop分光光度計(jì)檢查DNA濃度和質(zhì)量。PCR擴(kuò)增采用Biosystems?Gene Amp?PCR System 9700 擴(kuò)增儀。引物：515F（5′-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和 806（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。PCR 混合物（25 μL）含有 1×PCR 緩沖液，1.5 mmol/L MgCl2，0.4 μmol/L 脫氧核苷三磷酸，1.0 μmol/L各引物，0.5U KOD-Plus-Neo（TOYOBO）和10 ng模板DNA。PCR擴(kuò)增程序由94℃初始變性1 min，隨后30個(gè)循環(huán)（94℃變性20 s，54 ℃退火 3 s，72 ℃延伸 30 s），最后延伸在 72 ℃下5 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用OMEGA膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，OMEGA凝膠提取試劑盒純化電泳帶。

1.5 文庫構(gòu)建及測序

使用Illumina公司的TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit試劑盒構(gòu)建序列文庫。在Qubit@2.0熒光計(jì)和Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)上對測序文庫進(jìn)行評估。將文庫應(yīng)用于Rhonin Biosciences有限公司的Illumina Hiseq裝置進(jìn)行雙端測序（2×250 bp）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用QIIME中的PyNAST[9]對代表性序列進(jìn)行比對并去除低質(zhì)量、接頭污染和低復(fù)雜的序列，用FLASH[10-11]對有效序列進(jìn)行拼接，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品。再用UPARSE[11]軟件將序列聚類到97%的操作分類單位OTUs[12]。篩選重復(fù)序列，使用Uchime[13]軟件去除嵌合體[14]。在QIIME中使用Silva database[15]和uclust進(jìn)行物種分類信息劃分，同時(shí)去除注釋為葉綠體、線粒體以及非乳酸菌的OTU。所有數(shù)據(jù)分析使用R[16]和Python（https：//www.python.org/）進(jìn)行。用 Vegan 計(jì)算 alpha多樣性指標(biāo)，基于這些指標(biāo)生成了稀釋曲線。相關(guān)性分析是尋找研究現(xiàn)象之間是否存在某種依存關(guān)系，并對具體有依存關(guān)系的現(xiàn)象探討其相關(guān)方向及程度的一種統(tǒng)計(jì)方法。具體在生態(tài)學(xué)研究中相關(guān)分析包括環(huán)境因子間的自相關(guān)、物種間豐度變化的相關(guān)性、群落與環(huán)境因子的相關(guān)性以及物種與環(huán)境因子的相關(guān)性[17-18]。計(jì)算物種豐度與環(huán)境因子的相關(guān)性及其顯著性，結(jié)合熱圖或聚類分析能更好地呈現(xiàn)計(jì)算結(jié)果[19]。選擇Spearman方法計(jì)算不同組間各個(gè)物種與每個(gè)環(huán)境因素的相關(guān)程度并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平為95%，并使用BH方法校正p值。使用歐氏距離和層次聚類算法（complete-linkage）對物種進(jìn)行聚類，然后基于聚類信息使用Heatmap進(jìn)行結(jié)果呈現(xiàn)同時(shí)給出顯著程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 干奶酪理化指標(biāo)測定結(jié)果

12個(gè)樣品中的主要組分測定如表2所示。除X1樣品外，其余的11個(gè)樣品蛋白質(zhì)含量都比較高，蛋白質(zhì)含量達(dá)到了44.061～57.850 g/100 g，而樣品X1的蛋白質(zhì)含量僅為24.967 g/100 g；脂肪含量最高的樣品為X2，其脂肪含量為31.38 g/100 g，X3樣品脂肪含量最低，其含量為4.1g/100 g；X4樣品水分含量最高，為22.25 g/100 g，X2樣品水分含量最低，僅為5.16 g/100 g；樣品 X8的 Ca含量最高為980.402 mg/kg，X3 含量最低為 223.172 mg/kg；樣品X7的酸度最高，為126.59 mL/100 g，樣品X5的酸度最低為71.96 mL/100 g。上述組分的含量測定結(jié)果表明新疆傳統(tǒng)干奶酪中含有豐富的營養(yǎng)成分。

2.2 樣品α多樣性分析

α多樣性分析可以反映微生物群落的豐度、均勻性及多樣性。按照barcode標(biāo)簽區(qū)分樣品序列，過濾低質(zhì)量序列。將過濾后的序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，去除嵌合體，共得到60 056條有效數(shù)據(jù)，聚類為715個(gè)OTU?；贠TU的分析結(jié)果，分別計(jì)算Shannon和Chao1指數(shù)。利用chao1算法估計(jì)樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，結(jié)果如表2。所有樣品觀測到的OTUs為59.58±7.73。利用香農(nóng)-維納指數(shù)估算樣本中微生物多樣性，Shannon指數(shù)整體相差不大（2.58±0.15）。

分別使用Observed、Chao1及Shannon指數(shù)進(jìn)行稀釋曲線的制作，結(jié)果如圖1所示。通過分析Observed 指數(shù)稀釋曲線，樣品 X1、X2、X6、X7、X8、X12的稀釋曲線都趨于平緩，表明測序深度充分，OTU的數(shù)量接近于飽和，測序深度基本覆蓋到樣品中所有的物種。樣品X10和X11的稀釋曲線隨著測序深度增加上升趨勢較為明顯，還需要進(jìn)一步加大測序深度，以更好地反映其真實(shí)情況。分析Chao1指數(shù)稀釋曲線，樣品 X1、X2、X3、X5、X6、X7、X8 的稀釋曲線趨于平緩，表明測序深度足以覆蓋樣品物種總數(shù)。另外Shannon曲線都趨于平穩(wěn)，表明干奶酪中物種總數(shù)的測序深度已足夠。

表1 干奶酪理化指標(biāo)測定結(jié)果Table 1 Dry cheese physical and chemical indicators

表2 不同樣品中α多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index in different samples

2.3 樣品間屬水平乳酸菌群落結(jié)構(gòu)分析

圖1 12份新疆干奶酪乳酸菌類群稀釋曲線Figure 1 Rarefaction curves of lactic acid bacteria in 12 Xinjiang dry cheeses

在97%相似水平上對OTU序列進(jìn)行門、綱、目、科、屬、種分類學(xué)分析，共得到2個(gè)門、2個(gè)綱、2個(gè)目、7個(gè)科、12個(gè)屬，如圖2所示。2個(gè)門為厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria），2個(gè)綱為芽孢桿菌綱（Bacilli）和放線菌綱（Actinobacteria），2個(gè)目為乳桿菌目（Lactobacillales）和雙歧桿菌目（Bifidobacteriales），7個(gè)科分別為氣球菌科（Aerococcaceae）、肉桿菌科（Carnobacteriaceae）、腸球菌科（Enterococcaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、明串珠菌科（Leuconnstocaceae）、鏈球菌科（Streptococcaceae）和雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）；12 個(gè)乳酸菌屬分別為Carnobacterium、Aerococcus、Marinilactibacillus、Lactococcus、Vagococcus、Tetragenococcus、Fructobacillus、Enterococcus、Pediococcus、Weissella、Lactobacillus和Bifidobacterium。其中Lactobacillus、Bifidobacterium、Weissella和Pediococcus是優(yōu)勢菌屬（＞1%），占所測得乳酸菌類群的98.65%±1.52%。Lactobacillus在所有樣品中含量都為最高，其中庫爾勒中的X2樣品Lactobacillus占到了76.79%；此外，Bifidobacterium和Weissella分別在額敏的 X4（27.18%）和 X5（14.74%）樣品中所占的比例最大；在伊犁的X11中Pediococcus所占比例為（4.04%）。另外，庫爾勒樣品中沒有檢測到Carnobacterium和Marinilactibacillus；額敏樣品中只檢測到8個(gè)屬，沒有檢測到Tetragenococcus、Vagococcus、Lactococcus和Carnobacterium；伊犁樣品中沒有檢測到Vagococcus、Marinilactibacillus和Aerococcus；烏魯木齊樣品中囊括12個(gè)菌屬，其中X9的乳酸菌屬就達(dá)到了11個(gè)屬，在所有樣品中是最豐富的。

2.4 樣品間種水平乳酸菌多樣性分析

種水平上測定到9種優(yōu)勢乳酸菌菌種（＞1%），9種乳酸菌可歸為6個(gè)屬。乳桿菌屬有Lactobacillus bucbneri、Lactobacillus paracollinoides和Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus。Pediococcus有Pediococcus damnosus和Pediococcus ethanolidurans。其他4個(gè)菌屬各有一種，分別為短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）、類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、Leuconostoc mesenteroides、Tetragenococcus halophilus。對這9種乳酸菌種進(jìn)行水平聚類熱圖分析，如圖3所示，干奶酪樣品中短雙歧桿菌和類腸膜魏斯氏菌中含量最豐富。其中，Bifidobacterium breve和Weissella paramesenteroides分別在額敏的X4（26.39%）和 X5（14.20%）中所占的比例最大。另外，只在烏魯木齊X9中鑒定到具有較高豐度的Leuconostoc mesenteroides（1.67%）和Tetragenococcus halophilus（1.32%）。

2.5 乳酸菌類群與干奶酪養(yǎng)分組成相關(guān)性分析

選擇Spearman方法對樣品中的理化成分與乳酸菌類群進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，其結(jié)果用熱圖展示。如圖4所示，Lactobacillus受脂肪的影響較大（P＜0.01），呈正相關(guān)；Bifidobacterium受脂肪和水分的影響都比較顯著，脂肪對其的影響呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），水分對其影響為正相關(guān)（P＜0.05）；Weissella受水分的影響比較顯著，呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；Marinilactibacillus受 Ca的影響比較顯著（P＜0.05）。Pediococcus受蛋白質(zhì)的影響較大，呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。Tetragenococcus受pH和酸度的影響都比較顯著，pH對其影響呈正相關(guān)（P＜0.05），酸度對其影響呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

圖2 12份新疆干奶酪中屬水平乳酸菌菌群分布Figure 2 12 samples of Xinjiang cheese lactic acid bacteria in the genus level distribution

圖3 12份新疆干奶酪中乳酸菌種水平類群聚類熱圖Figure 3 Cluster heat map of lactic acid bacteria in 12 Xinjiang dry cheeses

3 討論

近年來，乳酸菌作為益生菌廣泛應(yīng)用于食品及藥品領(lǐng)域中，含有大量乳酸菌的乳制品是營養(yǎng)與保健功能兼?zhèn)涞默F(xiàn)代人的理想食品之一[20]。本研究應(yīng)用lllumina高通量測序技術(shù)分析12份新疆干奶酪中乳酸菌的多樣性，探討了干奶酪中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)組成。挖掘到的乳酸菌可歸為2個(gè)目7個(gè)科12個(gè)屬，其中Lactobacillus、Bifidobacterium、Weissella和Pediococcus是優(yōu)勢菌屬，占到所測得乳酸菌類群的98.65%±1.52%。同國內(nèi)外奶酪中的優(yōu)勢乳酸菌屬相比，存在一定差異。呼斯楞[21]和Masoud等[22]分別對哈薩克斯坦傳統(tǒng)奶酪和丹麥的Danish raw milk奶酪中的乳酸菌分析發(fā)現(xiàn)，其優(yōu)勢菌屬均為Lactobacillus、Lactococcus和Streptococcus，段宇珩等[23]從青海曲拉中檢測到的優(yōu)勢菌屬為Leuconostoc、Enterococcus、Lactobacillus。另外，本研究在庫爾勒樣品中沒有檢測到Carnobacterium和Marinilactibacillus；額敏樣品中只檢測到8個(gè)屬，沒有檢測到Tetragenococcus、Vagococcus、Lactococcus和Carnobacterium；伊犁樣品中沒有檢測到Vagococcus、Marinilactibacillus和Aerococcus；烏魯木齊樣品中囊括12個(gè)菌屬，其中X9的乳酸菌屬就達(dá)到了11個(gè)屬，在所有樣品中是最豐富的。

在種水平上檢出的9種優(yōu)勢乳酸菌種分別為Lactobacillus bucbneri、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus、Pediococcus damnosus、Pediococcus ethanolidurans、Bifidobacterium breve、Weissella paramesenteroides、Leuconostoc mesenteroides和Tetragenococcus halophilus。其中Bifidobacterium breve和Weissella paramesenteroides的豐度較高，其分別來自于雙歧桿菌屬和魏斯氏菌屬。另外，只在烏魯木齊X9中鑒定到具有較高豐度的Leuconostoc mesenteroides（1.67%）和Tetragenococcus halophilus（1.32%）。而愛爾蘭奶酪中的優(yōu)勢菌種來自乳球菌屬[24]，丹麥原奶酪中的優(yōu)勢菌種來自乳桿菌屬和鏈球菌屬[25]，馬蘇里拉奶酪中的優(yōu)勢菌種來自嗜熱鏈球菌屬[26]。El-Baradei等[27]和張蓓[28]分別對埃及Domiati奶酪和藏族傳統(tǒng)曲拉中乳酸菌檢測分析，Leuconostoc mesenteroides均為優(yōu)勢菌，包秋華[29]從曲拉中檢測到的優(yōu)勢菌為Lactobacillus helveticus。此外，類腸膜魏斯氏菌在國內(nèi)外的奶酪制品中鮮有報(bào)道。

物種干奶酪內(nèi)環(huán)境關(guān)性分析表明，Weissella受水分的影響較大，Bifidobacterium受脂肪和水分的影響較顯著，Tetragenococcus受pH和酸度的影響也比較顯著，Lactobacillus受脂肪的影響較大，Marinilactibacillus受Ca的影響比較顯著，Pediococcus受蛋白質(zhì)的影響較大。環(huán)境關(guān)聯(lián)性分析表明多種因素共同影響著新疆干奶酪乳酸菌多樣性。另外，本研究得到的優(yōu)勢菌種Bifidobacterium breve是腸內(nèi)的益生菌群，具有抑制腸道病原菌生長、改善蛋白質(zhì)代謝、提供維生素、降低膽固醇、提高免疫機(jī)能和抗氧化等生理功能[30-32]，還可以幫助早產(chǎn)兒吸收人乳寡糖[33]。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以著重對優(yōu)勢菌株和產(chǎn)脂肪酶乳酸菌進(jìn)行篩選，并探究其功能性。

本研究通過對干奶酪中優(yōu)勢乳酸菌多樣性的認(rèn)識及環(huán)境相關(guān)性的分析，可為今后挖掘有商業(yè)價(jià)值的區(qū)域性特色乳酸菌提供參考依據(jù)，從而更好地促進(jìn)我國土著乳酸菌資源開發(fā)的深度與廣度。