CRISPR/Cas9技術(shù)敲減Ku80基因?qū)θ巳轭^狀甲狀腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

范亞莉,王娟紅,魏 威,方航榮,段 瑛,李娜苗,張瑩瑩,李建英

(1西安市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科,西安 710003;2延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院;3西安市第三醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:657237987@qq.com)

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。甲狀腺癌中80%-85%為甲狀腺乳頭狀癌(PTC)[1]。PTC好發(fā)于中、青年女性,大多數(shù)患者預(yù)后良好,然而,部分患者仍存在復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、甚至因癌死亡的風(fēng)險(xiǎn)[2-4]。近年來,全世界范圍內(nèi),PTC發(fā)病率顯著上升,部分患者還表現(xiàn)為甲狀腺內(nèi)的多發(fā)癌。研究PTC病因及發(fā)病機(jī)制,尋求除手術(shù)治療、I131治療以外其他潛在的新的治療方案對(duì)于預(yù)防及治療PTC,提高PTC患者預(yù)后具有重要意義。

Ku80是Ku70/Ku80異源二聚體的組成單位,廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),在非同源末端連接(NHEJ)DNA修復(fù)中具有重要作用。Ku80可以與斷裂的DNA雙鏈末端結(jié)合,吸引DNA依賴性蛋白激酶并引發(fā)NHEJ途徑的DNA修復(fù)[5]。Ku80除了具有DNA修復(fù)作用之外,還涉及其他細(xì)胞過程,包括端粒維持、抗原受體基因排列、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、集落形成和細(xì)胞凋亡等[6]。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)Ku80蛋白的活性與某些惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[7]。本課題組在前期研究中,通過免疫組化實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)人甲狀腺乳頭狀癌組織中Ku80蛋白高水平表達(dá),而且發(fā)現(xiàn)Ku80的表達(dá)與腫瘤TNM分期中腫瘤T分期相關(guān)。本次研究擬在細(xì)胞水平上,進(jìn)一步研究Ku80基因及其表達(dá)在PTC中的作用。我們檢測(cè)PTC癌細(xì)胞株K1及B-CPAP細(xì)胞中Ku80的mRNA表達(dá)水平,并應(yīng)用CRISPR/Cas9敲減技術(shù),研究Ku80對(duì)PTC癌細(xì)胞生物學(xué)功能,包括增殖、凋亡、侵襲和克隆形成能力等的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株K1(購自European Collection of Cell Cultures,ECOCC)維持在補(bǔ)充有10%胎牛血清的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基中,甲狀腺乳頭狀癌B-CPAP細(xì)胞株(購自中科院上海細(xì)胞庫)維持在補(bǔ)充有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中(美國,Gibco公司)。Ku80兔抗人一抗購自美國Cell Signaling公司。胎牛血清FBS購自澳洲Ausbian公司、DMEM培養(yǎng)基購自美國Cornning公司、胰蛋白酶購自上?；瘜W(xué)試劑公司。CRISP/CAS9雙載體慢病毒購自上海吉?jiǎng)P基因有限公司,且由該公司完成CRISP/CAS9雙載體慢病毒包裝并測(cè)序驗(yàn)證。Lipofectamine2000購自美國invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Ku80在不同細(xì)胞株中的表達(dá) ①總RNA的提取:使用Trizol試劑盒在K1、B-CPAP細(xì)胞中提取總RNA,Nanodrop 2000/2000C分光光度計(jì)分析測(cè)定所抽提RNA的濃度及質(zhì)量。②cDNA的合成:取2 μg總RNA,1 μl Oligo dT(0.5 μg/μl),1 μl M-MLV-RTase(200 U/μl),于42 ℃水浴反應(yīng)1 h,70 ℃水浴10 min獲取cDNA。內(nèi)參基因和目的基因引物由吉?jiǎng)P基因設(shè)計(jì)和合成(上下游引物信息見表1,GAPDH為內(nèi)參引物)。③PCR反應(yīng):以同一cDNA為模板,在20 μl反應(yīng)體系內(nèi)擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min后,95 ℃ 50 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,循環(huán)35次，最后72 ℃延伸7 min。取5 μl PCR產(chǎn)物于1.8%瓊脂糖凝膠電泳(80 V,30 min),凝膠成像儀分析RT-PCR產(chǎn)物帶的積分吸光度值。用XRCC5/GAPDH擴(kuò)增量表示細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)水平(Ku80亞單位由XRCC5編碼,故Ku80又稱XRCC5)。

表1 目的基因與內(nèi)參基因的上下游引物序列Table 1 Upstream and downstream primer sequences of the target gene and the internal reference gene

1.2.2 CRISP/CAS9系統(tǒng)慢病毒包裝 由上海吉?jiǎng)P基因有限公司設(shè)計(jì)三條小向?qū)NA(small guide RNA,sgRNA)靶點(diǎn)序列。根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)的sgRNA序列分別為:5′-GTCATAAGCATATCGAACTA-3′,5′-TCATATCAAGCATAACTATG-3′及5′-GGTTCAGAGAAGATTCTTCA-3′,根據(jù)sgRNA序列設(shè)計(jì)PCR引物,以基因組為模板擴(kuò)增,對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行PCR測(cè)序。結(jié)果顯示:sgRNA處不存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn),可進(jìn)行細(xì)胞感染。CRISP/CAS9系統(tǒng)(購買自上海吉?jiǎng)P基因有限公司)慢病毒包裝由上海吉?jiǎng)P基因有限公司完成并測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 細(xì)胞感染 ①培養(yǎng)狀態(tài)良好的K1及B-CPAP細(xì)胞鋪板(6孔板),進(jìn)行Puromycin抗體標(biāo)記的Cas9-Puro慢病毒感染。K1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用病毒滴度為2×108TU/ml,病毒用量10 μl;感染條件為Eni.S+polybrene(Enhanced Infection Solution+polybrene,感染增強(qiáng)劑和助感染試劑),感染復(fù)數(shù)(MOI)為10,感染后16 h換液,72 h拍照。感染后72 h加入Puromycin處理(Puromycin工作終濃度為4.00 μg/ml,維持濃度2.00 μg/ml)篩選。B-CPAP細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用病毒滴度為2×108TU/ml,病毒用量5 μl;感染條件為Eni.S+polybrene,MOI為5,感染后16 h換液,72 h拍照。感染后72 h加入Puromycin處理(Puromycin工作終濃度2.00 μg/ml,維持濃度1.00 μg/ml)篩選。篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)CAS9的混合克隆細(xì)胞株:CAS9-K1及CAS9-B-CPAP。②培養(yǎng)狀態(tài)良好的穩(wěn)定表達(dá)CAS9的CAS9-K1及CAS9-B-CPAP細(xì)胞鋪板,進(jìn)行LV-Ku80-sgRNA慢病毒感染。CAS9-K1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用病毒滴度為1×109TU/ml,病毒用量1 μl;感染條件為Eni.S+polybrene,MOI為10,感染后16 h換液,72 h拍照。CAS9-B-CPAP實(shí)驗(yàn)用病毒滴度為3×108TU/ml,病毒用量3.3 μl;感染條件為Eni.S+polybrene,MOI為5,感染后16 h換液,72 h拍照。

1.2.4 Cruiser酶切檢測(cè)CAS9-sgRNA活性 收集培養(yǎng)狀態(tài)良好的CRISPR/CAS9處理后的細(xì)胞株K1及B-CPAP(感染7 d后收集細(xì)胞檢測(cè)),用基因組DNA提取試劑盒抽提樣品基因組,按照設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物(包含切割靶點(diǎn)),在50 μl反應(yīng)體系中(上、下游引物各1 μl,2×Taq Plus Master Mix 25 μl,Genomic DNA 2 μl,ddH2O21 μl)進(jìn)行PCR反應(yīng)(95 ℃ 2 min變性,95 ℃ 20 S,75 ℃ 20 S,72 ℃ 30 S,35循環(huán)擴(kuò)增,72 ℃ 5 min延伸,95 ℃ 5 min變性),獲得雜交DNA產(chǎn)物。在滅菌PCR管中配置10 μl反應(yīng)體系(PCR產(chǎn)物2-3 μl,Detecase Buffer 2 μl,Detecase 1 μl,Add ddH2O至10 μl),45 ℃反應(yīng)20 min后,立即向上述10 μl體系內(nèi)加入2 μl終止液,然后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)檢測(cè)經(jīng)CRISPR/CAS9處理后K1細(xì)胞中Ku80蛋白表達(dá) 收集生長狀態(tài)良好的感染后K1細(xì)胞,提取總蛋白,測(cè)定蛋白濃度。將稀釋的抗體,稀釋變性的蛋白樣本及其他試劑按設(shè)定程序加入板中,使用全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)(WES)檢測(cè)K1-Cas9穩(wěn)定株細(xì)胞中Ku80的蛋白表達(dá)量。蛋白上樣量1 μg,一抗兔抗人Ku80抗體稀釋比例為1 ∶300。使用普諾森二抗兔IgG試劑盒。目的條帶83 kD。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)Compass軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.6 qPCR檢測(cè)經(jīng)CRISPR/CAS9處理后B-CPAP細(xì)胞中Ku80相關(guān)mRNA的表達(dá)豐度 收集培養(yǎng)狀態(tài)良好的CRISPR/CAS9處理后細(xì)胞B-CPAP,提取RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用real time PCR方法檢測(cè)Ku80相關(guān)mRNA的表達(dá)情況,內(nèi)參基因GAPDH,引物由吉?jiǎng)P基因設(shè)計(jì)和合成。

1.2.7 MTT法檢測(cè)Ku80敲減對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響 將處于對(duì)數(shù)生長期的實(shí)驗(yàn)組(KO)、陰性對(duì)照組(NC)、空病毒組(CON)三組細(xì)胞胰酶消化,重懸成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù),接種5張96孔板。接種細(xì)胞數(shù)2 000個(gè)/孔,每組3孔。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)終止前4 h加入20 μl 5 mg/ml的MTT于孔中,4 h后完全吸去培養(yǎng)液,加入100 μl DMSO。振蕩器振蕩2-5 min,酶標(biāo)儀490/570 nm檢測(cè)OD值(在進(jìn)行細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)中,一般以490 nm為檢測(cè)波長,570 nm為參考波長,兩者吸收光之差可以消除非特異波長,故以此來表示)。獲取K1及B-CPAP細(xì)胞隨時(shí)間變化(1-5 d)的OD490值及OD490變化倍數(shù),繪制時(shí)間-效應(yīng)曲線。

1.2.8 Ku80敲減對(duì)細(xì)胞侵襲的影響 使用Corning侵襲試劑盒,按照試劑盒說明書操作,準(zhǔn)備侵襲小室,接種細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)為50 000/孔)至小室。培養(yǎng)體系為24孔板,內(nèi)室500 μl/孔,外室750 μl/孔。實(shí)驗(yàn)分實(shí)驗(yàn)組KO、陰性對(duì)照組NC、空病毒感染組MOCK組三組,每組3孔。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h。Giemsa染色,晾干。顯微鏡拍照、隨機(jī)選取5個(gè)鏡下視野計(jì)數(shù)、進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.9 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞胰酶消化,分組同1.2.8侵襲實(shí)驗(yàn),重懸成細(xì)胞懸液接種于6孔板中,在培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)13 d,熒光顯微鏡下照相,多聚甲醛固定細(xì)胞,PBS洗滌,Giemsa染色,晾干,數(shù)碼相機(jī)拍照,顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù),最后計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%,兩組細(xì)胞克隆形成率以配對(duì)樣本的秩和檢驗(yàn)作統(tǒng)計(jì)分析;P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.10 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分三組進(jìn)行,分組同1.2.8侵襲實(shí)驗(yàn),當(dāng)6孔板細(xì)胞生長至覆蓋率約為85%時(shí)藥物誘導(dǎo)凋亡,若為貼壁細(xì)胞,則上清中細(xì)胞也需收集。胰酶消化,完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液,與上清細(xì)胞收集于同一5 ml離心管中,每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔,若為懸浮細(xì)胞,直接收集。1 300 r/min離心5 min,棄上清,4 ℃預(yù)冷的D-Hanks(pH=7.2-7.4)洗滌細(xì)胞沉淀。1×binding buffer洗滌細(xì)胞沉淀一次,1 300 r/min、3 min離心,收集細(xì)胞。200 μl 1×binding buffer重懸細(xì)胞沉淀。加入10 μl Annexin V-APC染色,室溫避光10-15 min。根據(jù)細(xì)胞量,補(bǔ)加400-800 μl 1×binding buffer,上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Ku80 mRNA分別在K1、B-CPAP細(xì)胞中的表達(dá)

RT-PCR技術(shù)定量檢測(cè)Ku80 mRNA在不同細(xì)胞中的表達(dá)豐度。通過溶解曲線分析,結(jié)果均為單一峰,說明PCR擴(kuò)增特異性較好,樣本3次重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的重復(fù)性較好。從定量PCR結(jié)果可以看出,Ku80基因在兩株細(xì)胞中的表達(dá)豐度均為高豐度(見圖1)。

1.K1細(xì)胞株; 2.B-CPAP細(xì)胞株; M.DNA Marker DL 1000(TAKARA,Code No. D526A)

2.2 應(yīng)用CRISP/CAS9系統(tǒng)感染K1及B-CPAP細(xì)胞后對(duì)Ku80表達(dá)的影響

K1及B-CPAP細(xì)胞鋪板,進(jìn)行Puromycin抗體標(biāo)記的Cas9-Puro慢病毒感染后,篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)CAS9的混合克隆細(xì)胞株,繼續(xù)進(jìn)行LV-XRCC5-sgRNA慢病毒感染。通過Cruiser酶切檢測(cè)CAS9-sgRNA活性可以看出K1-cas9-穩(wěn)定株實(shí)驗(yàn)組所對(duì)應(yīng)的KO1、KO2、KO3靶點(diǎn)及B-CPAP-cas9-穩(wěn)定株實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的KO靶點(diǎn)(與K1細(xì)胞中KO1序列一致)均檢測(cè)出活性,靶點(diǎn)序列如1.2.2所示。結(jié)果提示穩(wěn)定表達(dá)CAS9及LV-XRCC5-sgRNA的慢病毒感染成功(見圖2)。

2.3 CRISPR/CAS9處理后K1細(xì)胞及B-CPAP細(xì)胞中Ku80表達(dá)水平測(cè)定

檢測(cè)結(jié)果經(jīng)Compass軟件進(jìn)行灰度分析,發(fā)現(xiàn)在K1-Cas9穩(wěn)定株細(xì)胞中Ku80表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。qPCR檢測(cè)CRISPR/CAS9系統(tǒng)處理后B-CPAP細(xì)胞中Ku80mRNA的表達(dá)豐度,結(jié)果顯示:B-CPAP細(xì)胞中,實(shí)驗(yàn)組Ku80mRNA表達(dá)水平是對(duì)照組的0.443倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),可進(jìn)行基因敲減后的功能試驗(yàn)研究(見圖3)。

2.4 Ku80敲減后對(duì)K1、B-CPAP細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及克隆形成的影響

Cas9病毒與sgRNA病毒共同感染目的細(xì)胞后,K1細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組(KO)細(xì)胞第5天增殖活力及侵襲細(xì)胞數(shù)量,較對(duì)照組均顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而B-CPAP細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組(KO)細(xì)胞第5天增殖活力及侵襲細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組(NC)呈下降趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖4,5)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示,K1細(xì)胞KO組細(xì)胞凋亡較對(duì)照組顯著升高[(10.38±0.42)%vs(2.41±0.33)%];B-CPAP細(xì)胞KO組細(xì)胞凋亡數(shù)較對(duì)照組顯著升高[(7.91±0.34)%vs(4.61±0.17)%];兩株細(xì)胞凋亡差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖6)。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:相比對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組敲減Ku80表達(dá)的K1、B-CPAP細(xì)胞克隆形成細(xì)胞數(shù)量均顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖7)。

M. DL2502 Ladder Marker(條帶從小到大分別為100,250,500,750,1 000,1 500,2 000,3 000,5 000 bp);KO1-3.實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的3個(gè)靶點(diǎn);KO.實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的1個(gè)靶點(diǎn);NC.各實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照;CON.實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的空細(xì)胞對(duì)照;陽參:擴(kuò)增片段大小為493 bp,酶切片段大小分別為122 bp、371 bp

圖3 CRISPR/CAS9處理K1細(xì)胞及B-CPAP細(xì)胞后Ku80敲減效率測(cè)定Figure 3 Ku80 knockdown efficiency in K1 cells and B-CPAP cells after treatment by CRISPR/CAS9

3 討論

乳頭狀甲狀腺癌(PTC)是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤。過去20年來,由于對(duì)偶發(fā)結(jié)節(jié)的檢測(cè)技術(shù)得到改善,PTC的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)穩(wěn)步上升。PTC占所有甲狀腺癌的80%-85%,且很大程度上可以治愈,其5年生存率為98%[8]。然而,5%-20%的病例發(fā)生疾病復(fù)發(fā),并且是患者死亡的重要原因。因此,在初次確診PTC時(shí),風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和進(jìn)展性預(yù)測(cè)非常重要[9,10]。

分子生物標(biāo)志物因其在PTC中的診斷和預(yù)后標(biāo)志物的潛在用途而被廣泛認(rèn)可。Ku蛋白是由Ku80與Ku70兩亞基緊密結(jié)合形成的異二聚體結(jié)構(gòu),在DNA末端具有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性,能激活相關(guān)蛋白表達(dá)。在電離輻射造成的雙鏈DNA斷裂(DSBs)的同源末端結(jié)合和非同源末端結(jié)合修復(fù)途徑中發(fā)揮重要作用[11,12]。研究發(fā)現(xiàn)Ku蛋白表達(dá)存在一種精細(xì)的平衡,Ku蛋白的過度表達(dá)促進(jìn)致癌基因表型,包括高增殖和抗凋亡性[13],然而表達(dá)不足或低表達(dá)Ku蛋白會(huì)導(dǎo)致基因不穩(wěn)定和腫瘤的形成[14]。有研究表明Ku80可以作為黏附分子并在細(xì)胞黏附、遷移和侵襲中發(fā)揮作用[15,16]。此外,譚卉妍等[17]的研究表明,Ku80具有多種生物活性,參與DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),可獨(dú)立參與細(xì)胞抗凋亡,并且在治療前列腺癌中,沉默Ku80的表達(dá),可以顯著提高細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。嚴(yán)姍姍等[18]通過回顧性分析223例鼻咽癌患者組織標(biāo)本中Ku80表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性提示,Ku80的表達(dá)與腫瘤N分期、M分期有關(guān),這說明Ku80可能與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移行為相關(guān)。Ku作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑通過與重組信號(hào)結(jié)合蛋白Jκ和核因子NF-κB p50同二聚體相互作用而上調(diào)p50的表達(dá),可能調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖[19]。

圖4 K1及B-CPAP細(xì)胞增殖變化曲線Figure 4 K1 and B-CPAP cell proliferation curve

與NC組比較,*P<0.05

與NC組比較,*P<0.05

本課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ku80在PTC癌組織中較正常癌旁組織呈高表達(dá),且與腫瘤TNM分期有一定的相關(guān)性。與其他腫瘤中Ku表達(dá)研究結(jié)果一致,為了更進(jìn)一步探究Ku80在甲狀腺乳頭狀癌中的具體功能,我們采用CRISPR/CAS9技術(shù),敲減甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中的Ku80表達(dá),通過MTT、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞侵襲及克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),抑制Ku80表達(dá),K1腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及克隆形成數(shù)目均顯著降低,且可有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。雖然在MTT實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中B-CPAP細(xì)胞的增殖活力和侵襲率與對(duì)照組相比并無差異,但是整體趨勢(shì)是細(xì)胞的增殖和侵襲能力受到抑制;為此,我們考慮到Ku80在細(xì)胞中表達(dá)豐度極高,CRISPR/CASE9技術(shù)敲減后B-CPAP細(xì)胞Ku80的敲減效率僅達(dá)到55.7%,仍有一定量的Ku80發(fā)揮作用,因此對(duì)B-CPAP細(xì)胞增殖、侵襲功能無顯著影響?？傮w來說,此研究結(jié)果提示Ku80過表達(dá)可能在PTC的發(fā)生、發(fā)展中起到促進(jìn)作用。

癌癥的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程,某種通路中相關(guān)基因的突變或者異位等均可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡,常見的基因突變包括BRAF、RET、RAS、PTEN等,基因易位如RET/PTC等[20]。為此,本課題下一步擬通過檢測(cè)RET、NF-κB等在PTC組織中的表達(dá)來進(jìn)一步研究其與Ku80蛋白在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展中具體通過哪些信號(hào)通路發(fā)揮作用。以相關(guān)靶基因?yàn)槟康幕蚴悄壳凹谞钕偃轭^狀癌精準(zhǔn)治療和個(gè)體化治療的關(guān)鍵所在,本研究發(fā)現(xiàn),PTC癌組織Ku80陽性表達(dá)率高于癌旁組織,Ku80表達(dá)下調(diào)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和克隆形成能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但其具體的作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的研究。