非編碼RNA甲基化與肝癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系研究進(jìn)展*

劉曉霓，劉秀紅 綜述，陳德喜 審校

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指不編碼蛋白質(zhì)的 RNA，其中包括 rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNA和lncRNA等多種已知功能的RNA和未知功能的RNA。非編碼RNA在生物體的生命活動(dòng)中發(fā)揮著極廣泛的調(diào)控作用，對(duì)其進(jìn)行深入研究，可能對(duì)揭示基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、基因敲除、人類疾病防治及生物進(jìn)化探索有重要意義[1]。DNA甲基化（DNA methylation）是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，DNA甲基化如同開關(guān)調(diào)控著許多腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。隨著人們對(duì)于非編碼RNA的認(rèn)識(shí)，針對(duì)非編碼RNA甲基化相關(guān)研究也越來越多[2]。

微小 RNA（microRNA，miRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是目前研究較為熱點(diǎn)的非編碼RNA，其中microRNA、lncRNA甲基化異?？赡苁怯绊懜伟┌l(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵信號(hào)，導(dǎo)致肝癌的發(fā)生、發(fā)展[3，4]。本文將對(duì)近幾年microRNA、lncRNA甲基化與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 m icroRNAs甲基化與肝癌

microRNA是一種廣泛存在于真核生物、大小約為20-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈小分子RNA，降解或是阻遏靶mRNA，參與生命過程許多的重要進(jìn)程。miRNAs功能失調(diào)是人類癌癥的共性，近年來miRNAs在HCC的甲基化狀態(tài)及其在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用備受關(guān)注[4]（表1）。

miRNA-200b可以明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、細(xì)胞周期和侵襲。研究miRNA-200b和BMI1的生物學(xué)功能中發(fā)現(xiàn)83.3%的肝癌組織中miRNA-200b顯著下調(diào)，相反66.7%的肝癌組織BMI1過表達(dá)。報(bào)告基因結(jié)果顯示BMI1是miRNA-200b的靶基因。肝癌組織中miRNA-200b啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平增高，miRNA-200b相應(yīng)表達(dá)下降。miRNA200b部分被DNA甲基化而沉默，可以通過靶向作用BMI1抑制肝癌的進(jìn)展[5]。miR-372可以調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期、凋亡、侵襲和預(yù)后，和腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切[6]。在肝癌細(xì)胞系和組織中檢測(cè)到miR-372上游相鄰CpG島的啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化，其在肝癌組織中的表達(dá)水平較低，與肝癌轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)[7]。miR-106a在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，與啟動(dòng)子低甲基化有關(guān)。報(bào)告基因檢測(cè)顯示tp53inp1和CDKN1A可能直接靶向作用于miR-106a。高表達(dá)miR-106a細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲性，加快細(xì)胞周期進(jìn)程，抗凋亡作用。miR-106a啟動(dòng)子低甲基化，導(dǎo)致miR-106a表達(dá)上調(diào)可能有助于肝癌的進(jìn)展[8]。miR-146a啟動(dòng)子DNA甲基化與其表達(dá)下調(diào)與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以作為一個(gè)潛在的肝癌抑制因子[9]。miR-148a在多種癌癥中表達(dá)下調(diào)，可能是腫瘤抑制子，miR-148a過表達(dá)具有抑制HCC細(xì)胞增殖和周期進(jìn)展的作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-148a由于GpG島超甲基化，介導(dǎo)其在HCC細(xì)胞的表達(dá)沉默。DNMT1過表達(dá)是miR-148a甲基化的原因[10]。miR-34家族作為癌變過程中腫瘤抑制網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。miR-34a、miR-34b/C的甲基化頻率均顯著高于癌旁非癌組織，miR-34b表達(dá)與CpG島甲基化呈負(fù)相關(guān)，提示DNA甲基化可能參與miR-34b在肝癌的失活[11]。MicroRNA-9調(diào)控失常見于多種腫瘤，探討HCC miR-9的表達(dá)和甲基化狀態(tài)與肝癌的相關(guān)性。結(jié)果顯示miR-9在HCC表達(dá)下調(diào)，甲基化頻率增高，與腫瘤大小相關(guān)。體外研究顯示其通過調(diào)控miR-9/IGF2BP1/AKT&ERK軸抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移作用，是潛在的治療靶標(biāo)和預(yù)后標(biāo)志物[12]。肝特異性 microRNA-122在多種 Huh7、HepG2和 QSG-7701肝癌細(xì)胞甲基化水平增高，表達(dá)下調(diào)，miRNA-122具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡作用，miRNA-122甲基化調(diào)節(jié)與肝癌進(jìn)展相關(guān)[13]。DNA 甲基阻斷劑可以使miR-122在HCC表達(dá)明顯上調(diào)，PPARγ/RXRα復(fù)合物在miR-122表觀調(diào)控中發(fā)揮重要作用，HBX蛋白與PPARγ結(jié)合，抑制miR-122轉(zhuǎn)錄，丙型肝炎病毒沒有這種作用[14]。miR-101，是一個(gè)重要的肝癌腫瘤抑制miRNA，以c-Myc介導(dǎo)方式通過PRC2復(fù)合物而被表觀抑制。反過來，它又抑制兩個(gè)PRC2兩個(gè)亞單位（EZH2和EED），建立了肝癌發(fā)生的雙向負(fù)反饋環(huán)?；謴?fù)miR-101表達(dá)可以抑制 HCC細(xì)胞多個(gè)惡性表型（STMN1，JUNB，和CXCR7）。HCC 細(xì)胞共過表達(dá)c-Myc和EZH2與miR-101低表達(dá)和HCC患者不良預(yù)后有關(guān)[15]。研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有HCC細(xì)胞系中miR-129-2高甲基化，表達(dá)下調(diào)。與癌旁組織比較，93%（39/42）HCC患者肝癌組織miR-129-2甲基化水平增高[16]。miR-129-2在肝癌細(xì)胞過表達(dá)，可以抑制增殖和克隆形成，與SOX4共表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)其抗腫瘤作用，提示甲基化介導(dǎo)的miR-129-2表達(dá)抑制可能提高癌基因SOX4的表達(dá)，肝癌發(fā)生有關(guān)[17]。HBx和乙肝相關(guān)HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。HBx在HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)miR-132啟動(dòng)子甲基化。MiR-132在HBV相關(guān)HCC組織中表達(dá)下降，和HBx表達(dá)相關(guān)[18]。HBx介導(dǎo)miR-101下調(diào)和DNMT3A上調(diào)增強(qiáng)多種抑癌基因的DNA甲基化，提示這可能是HBx介導(dǎo)肝癌發(fā)生的新的機(jī)制[19]。miR-335被宿主基因MEST內(nèi)含子所包含，miR-335的表達(dá)和MEST表達(dá)密切相關(guān)，說明內(nèi)含子miR-335與其宿主基因共表達(dá)，在HCC miR-335/MEST異常甲基化增高而致miR-335表達(dá)水平降低，與近處的轉(zhuǎn)移的HCC腫瘤相比，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的HCC腫瘤表達(dá)顯著降低[20]。異位表達(dá)miR-517a和 miR-517c抑制細(xì)胞增殖和阻斷G2/M周期，HCC細(xì)胞用DNA甲基化阻斷劑處理后，miR-517a和 miR-517c表達(dá)上調(diào)，提示二者在HCC細(xì)胞處于高甲基化狀態(tài)，可通過調(diào)控Pyk2促進(jìn)HCC的進(jìn)展[21]。miR-23b具有抑制HCC的增殖和侵襲的生物學(xué)功能。與癌組織相比，miR-23b在HCC中的表達(dá)明顯降低，而且高表達(dá)miR-23b的患者的總生存期

（Overall survival，OS）和無病生存期（Disease-free survival，DFS）明顯延長(zhǎng)，提示miR-23b是一個(gè)HCC預(yù)后的分子標(biāo)志物。miR-23b的下調(diào)與DNA甲基化有關(guān)[22]。用芯片的比較有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 HCC患者肝癌組織的miR-129-3p表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌組織miR-129-3p表達(dá)明顯下調(diào)，其啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，提示miR-129-3p甲基化與肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和不良預(yù)后密切相關(guān)[23]。miR-615-5p體內(nèi)外具有抑制肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。去甲基化酶KDM4B可以介導(dǎo) miR-615-5p啟動(dòng)子CpG島甲基化，下調(diào)miR-615-5p在肝癌中的表達(dá)，miR-615-5p可以下調(diào)Ras相關(guān)蛋白R(shí)AB24，進(jìn)而促進(jìn)肝癌上皮間質(zhì)化、黏附和血管生長(zhǎng)[24]。mir-1247-5p在多種癌細(xì)胞中起著不同的作用。在HCC，mir-1247-5p在HepG2細(xì)胞高度甲基化，肝癌臨床樣本及肝癌細(xì)胞株中mir-1247-5p轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)。mir-1247-5p異位表達(dá)明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制移植瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)?？梢燥@著下調(diào)Wnt3表達(dá)，提示miR-1247-5p可以是HCC治療和診斷的潛在標(biāo)志物[25]。miR-142參與調(diào)節(jié)癌癥患者腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成。miR-142在HCC中低表達(dá)，和TNM分期、轉(zhuǎn)移和分化有關(guān)。miR-142直接靶向抑制TGF-β，導(dǎo)致細(xì)胞活力、增殖、EMT和促血管生成的能力。miR-142在HCC的低表達(dá)與其高甲基化有關(guān)，可以增加TGF-β誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)。

表1 m icroRNA DNA甲基化在HCC發(fā)生中的作用

可見，miRNA基因的缺失、突變、擴(kuò)增或表觀遺傳沉默以及生物合成過程中的異常都可能導(dǎo)致miRNA表達(dá)水平的改變。而DNA甲基化可能是導(dǎo)致miRNA在腫瘤中表達(dá)沉默并影響其靶基因的表達(dá)和功能，進(jìn)而影響腫瘤生物學(xué)行為的重要方式之一。miRNA DNA甲基化是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，為腫瘤的診斷及治療提供了新的方法。

2 lncRNAs與肝癌

lncRNA是一組長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸、缺少特異完整的開放閱讀框、無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。一方面證據(jù)顯示某些特定的lncRNAs是肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，同時(shí)大量的lncRNAs DNA甲基化和組蛋白修飾影響肝癌的關(guān)鍵信號(hào)通路。某些特定的lncRNA基因的異常甲基化修飾可能是包括肝癌等腫瘤預(yù)后不良的至關(guān)重要的事件。另一方面，盡管大量的lncRNAs通過全基因組的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA的表達(dá)調(diào)控在很大程度上仍然模糊。

Zeb1-as1是一個(gè)特定lncRNA，在肝癌（尤其是轉(zhuǎn)移性肝癌）中表達(dá)上調(diào)。DNA甲基化分析顯示zeb1-as1啟動(dòng)子低甲基化，zeb1-as1低甲基化或zeb1-as1高表達(dá)與不良生存率相關(guān)。zeb1-as1促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，為肝癌的癌基因，提示zeb1-as1可作為HCC預(yù)后的生物標(biāo)志物。研究lncRNA-SRHC在肝癌的表達(dá)在HCC發(fā)病機(jī)制中的作用發(fā)現(xiàn)SRHC能抑制肝癌細(xì)胞增殖，在肝癌組織低水平表達(dá)與血清AFP高水平以及和腫瘤低程度分化有關(guān)。SRHC啟動(dòng)子區(qū)域CpG島DNA甲基化是其表達(dá)沉默的部分原因。lncRNA-MEG3（maternally expressed gene 3）作為腫瘤抑制基因，在HCC下調(diào)。lncRNA-MEG3啟動(dòng)子顯示高甲基化狀態(tài)，MEG3表達(dá)的調(diào)節(jié)是依賴于靶向作用DNMT1的miR-29。甲基化相關(guān)的特異性調(diào)節(jié)MEG3表達(dá)顯示了lncRNA和基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控之間的相互作用關(guān)系。lncRNA GAS5（Growth arrest special 5）過表達(dá)具有抗腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。其啟動(dòng)子的插入缺失多態(tài)性（rs145204276)和HCC的敏感性相關(guān)，rs145204276缺失可顯著增高HCC的風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)一步表型分析顯示，在HCC，rs145204276等位基因缺失和GAS5高表達(dá)相關(guān)。rs145204276的基因表型和GAS5啟動(dòng)子甲基化相關(guān)。rs145204276可能通過影響GAS5啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)有助于肝癌的形成。

此外，lncRNA除了自身DNA甲基化外，和抑癌基因以及miRNA的甲基化還存在交互作用，如反義lncRNA-TARID（for TCF21 antisense RNA inducing demethylation）與TCF21啟動(dòng)子和GADD45A（growth arrest and DNA-damage-inducible，alpha；a regulator of DNA demethylation）相互作用，通過誘導(dǎo)啟動(dòng)子去甲基化激活TCF21表達(dá)，提示lncRNA可以作為GADD45A介導(dǎo)的去甲基化的標(biāo)簽。特異性的lncRNAs位于腫瘤相關(guān)基因附近，可能更易于作為各種作用子位點(diǎn)特異性甲基化關(guān)鍵招募平臺(tái)。lncRNA-HULC可以通過誘導(dǎo)miR-9啟動(dòng)子CpG的甲基化激活miR-9表達(dá)。在肝癌靶向作用PPARA mRNA導(dǎo)致miR-9表達(dá)抑制，下調(diào)HCC脂質(zhì)代謝。提示受lncRNAs調(diào)控的下游基因的甲基化不受特異位點(diǎn)限制，為lncRNAs參與腫瘤相關(guān)基因的甲基化修飾提供更多的可能性。lncRNA-GIHCG在肝癌組織高表達(dá)，與肝癌大小、血管侵襲、腫瘤分期和不良預(yù)后有關(guān)，lncRNA-GIHCG可以通過招募 EZH2和 DNMT1到miR-200b/a/429啟動(dòng)子區(qū)，促進(jìn)miR-200b/a/429啟動(dòng)子甲基化，沉默其表達(dá)。lncRNA-ZNFX1-AS1可以通過下調(diào)miR-9啟動(dòng)子CpG島甲基化進(jìn)而上調(diào)miR-9表達(dá)，抑制肝癌生長(zhǎng)。lncRNA PCAT-14在肝癌病人中過表達(dá)，和肝癌手術(shù)以后的不良預(yù)后相關(guān)。PCAT-14可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、阻滯細(xì)胞周期。此外，PCAT-14可以通過誘導(dǎo)miR-372啟動(dòng)子甲基化進(jìn)而抑制其表達(dá)，而miR-372可以抵消PCAT-14對(duì)HCC的促增殖、侵襲和阻滯細(xì)胞周期的作用。PCAT-14可以通過miR-372調(diào)控ATAD2表達(dá)，激活Hedgehog通路。lncRNA-GIHCG在肝癌組織高表達(dá)，與腫瘤大小、微血管侵襲、BCLC分期、不良預(yù)后密切相關(guān)。GIHCG招募EZH2和DNMT1到miR-200b/a/429啟動(dòng)子區(qū)，促進(jìn)miR-200b/a/429 DNA甲基化進(jìn)而沉默其表達(dá)。

與miRNA相比，lncRNAs的表觀調(diào)控研究尚處于初期階段，lncRNAs DNA甲基化可能是未來腫瘤診斷和預(yù)后的重要因子。

3 結(jié)語

人類基因組中僅有約2%的DNA序列最終編碼生成蛋白質(zhì)，其余絕大部分區(qū)域轉(zhuǎn)錄形成非編碼RNA。非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄受到嚴(yán)格的調(diào)控，其表達(dá)譜細(xì)胞特異性和組織特異性甚至高于蛋白編碼基因。尋找和發(fā)現(xiàn)疾病過程中非編碼RNA表達(dá)變化的原因，了解非編碼RNA上游調(diào)控機(jī)制，是非編碼RNA研究領(lǐng)域重要組成部分，而表觀遺傳學(xué)正是從基因組層面研究RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要領(lǐng)域。

目前miRNAs甲基化與肝癌的關(guān)系研究較為廣泛和深入，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的lncRNAs被發(fā)現(xiàn)，多種lncRNAs在肝癌中異常表達(dá)，可以作為抑癌或促癌基因參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。尤其近年來，有研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs也編碼微肽，lncRNAs表觀調(diào)控已成為肝癌乃至其他疾病發(fā)生發(fā)展的研究熱點(diǎn)。