復方丹參滴丸9種自制對照品純度定值研究

羅學軍，田介峰，閻 紅，王瑞靜，李瑞明，宋兆輝，何 毅*

(1.天士力控股集團有限公司天士力研究院，天津 300410； 2.天士力醫(yī)藥集團股份有限公司創(chuàng)新中藥關鍵技術國家重點實驗室，天津 300410)

化學標準物質的定值國際上通常采用質量守恒法，即分別測定標準物質中的有關物質、水分、殘留溶劑及無機雜質的含量，其與主成分的含量之和應為100%[1]。定量核磁共振(QNMR)技術作為一種日益成熟的儀器分析方法,具有傳統(tǒng)方法不可比擬的優(yōu)勢,如無需待測物對照品、樣品預處理步驟簡單、測定快速準確、專屬性強、不破壞樣品,在藥品質量控制與標準物質研究領域中的應用越來越廣泛[2-5]。復方丹參滴丸是全球首個由中國自主研發(fā)的產品完成美國FDA Ⅲ期臨床試驗，也是首個獲得美國FDA Ⅲ期臨床試驗陽性結果的復方中藥[6]，其質控相關的對照品由企業(yè)自制獲得，自制對照品賦值的準確性直接影響臨床樣品的檢測結果，因此至關重要。本文通過上述2 種方法的定值比較研究，可以更好地保障企業(yè)自制對照品賦值的準確性。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高 效 液 相 色 譜 儀，美國Agilent；Advance DRX 500 Bruker型核磁共振儀，德國Bruker；METTLER XP205電子天平。丹參素鈉(批號20150323)、原兒茶醛(批號20150306)、丹酚酸A(批號20150329)、丹酚酸B(批號20150804)、丹酚酸T/U(批號20150330)、三七皂苷R1(批號20150421)、人參皂苷Rg1(批號20150415)、人參皂苷Re(批號20150428)和人參皂苷Rb1(批號20150415)對照品由天士力集團研究院現代中藥開發(fā)中心自制；富馬酸對照品(批號20618)和馬來酸對照品(批號30318)采購自Dr. Ehrenstorfer GmbH；色譜純乙腈，Dikma；色譜純甲醇，Sigma；DMSO-d6，Merck；磷酸為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1質量守衡法計算相對純度

2.1.1酚酸類對照品色譜純度檢測

2.1.1.1液相色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：以0.02%磷酸水溶液為流動相A，以乙腈-0.02%磷酸水溶液8∶2為流動相B，進行梯度洗脫；洗脫梯度：0～8 min,90%A→78%A,10%B→22%B;8～15 min，78%A→74%A,22%B→26%B;15～35 min,74%A→61%A,26%B→29%B;35～40 min，61%A→90%A, 39%B→10%B; 40～50 min, 90%A,10%B；流速: 1 ml/min；檢測波長:280 nm;柱溫：30 ℃；進樣量: 10 μl[7]。

2.1.1.2檢測 取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B和丹酚酸T/U自制對照品，每份約5 mg，精密稱定，丹參素鈉和丹酚酸B用水，其余用甲醇分別溶解并制成每1 ml含0.2 mg 對照品的溶液，即得。在280 nm下檢測，除主峰外，可見雜質峰檢出，按峰面積歸一化法計算，結果見表1。

2.1.2皂苷類對照品色譜純度檢測

2.1.2.1液相色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：以水為流動相A，以乙腈為流動相B進行梯度洗脫；洗脫梯度：0～12 min,81%A,19%B；12～60 min, 81%A→64%A,19%B→36%B；60～61 min,64%A→81%A,36%B→19%B；61～70 min,81%A,19%B;流速:1 ml/min；檢測波長: 203 nm；柱溫：30 ℃；進樣量: 10 μl[8]。

2.1.2.2檢測 取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1對照品自制對照品，每份約4 mg，精密稱定，用甲醇分別溶解制成每 1 ml含0.4 mg 的溶液，即得。在203 nm下檢測，除主峰外，可見雜質峰檢出，按峰面積歸一化法計算，結果見表1。

2.1.3水分 以上9種自制對照品按照USP37-NF29<921>Ⅰa所規(guī)定的Karl-Fischer 方法進行水分測定，結果見表1。

2.1.4殘留溶劑 按照USP37-NF32<467>所規(guī)定方法對各對照品進行溶劑殘留分析，結果見表1。

2.1.5灰分 按照USP37-NF29<281>所規(guī)定方測定各對照品中的灰分，結果見表1。

2.1.6質量守衡法計算結果 相對純度=色譜純度×(1-水分含量-殘留溶劑含量-灰分含量)×100%，計算各自制對照品相對純度，結果見表1。

表1 9種自制對照品相對純度結果 %

2.2核磁共振定量法計算絕對純度

2.2.1供試品溶液的制備 分別取各對照品約15 mg及內標物質(富馬酸、馬來酸)15 mg，精密稱定，一式2份，分別用0.7 ml DMSO-d6完全溶解，振蕩搖勻，即得。

2.2.2核磁共振定量法測定結果 將供試品溶液約全部轉入5 mm核磁管中，測定。根據各對照品與內標物質核磁共振譜圖，選擇定量峰進行定量計算。絕對純度=(A樣/A內)×(n內/n樣)×(W內/W樣)×(M樣/M內)×內標物質純度×100%。計算各對照品絕對純度，其中A樣為各對照品選定信號的積分面積，A內為內標物質選定信號的積分面積，n樣為各對照品被積分信號包含的質子數，n內為內標物質被積分信號包含的質子數，W樣為對照品稱樣量，W內為內標物質稱樣量，M樣為各對照品相對分子質量，M內為內標物質相對分子質量。結果以核磁共振定量法計算丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸T/U、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1絕對純度(n=2)依次為99.24%、100.48%、95.12%、95.22%、94.74%、99.11%、94.66%、98.22%和95.32%。

3 討論

3.1質量守衡法涉及對照品色譜純度、水分、殘留溶劑和灰分等諸多測定環(huán)節(jié)，核磁共振定量法測定絕對純度，不受水分、殘留溶劑和無機雜質的影響，操作相對簡單。9種自制對照品丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸T/U、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1(相對純度-絕對純度)×100%分別為：-0.90%、-0.80%、-0.16%、-0.52%、-1.25%、-5.02%、2.42%、-3.76%和-0.54%。盡管2 種方法測定原理不同，但是除了三七皂苷R1和人參皂苷Re外其余測定結果基本一致，能夠更好地相互佐證9種自制對照品賦值的準確性。

3.2由于丹參素鈉中含有金屬元素Na，因此熾灼殘渣檢查法無法準確測定化合物中所含的不燃性無機物的含量，故其灰分測定結果僅供參考，沒有計入純度計算。

3.3定量核磁技術尚未普及 ,且對于圖譜的處理及峰歸屬的判斷還不能完全實現自動化, 故 QNMR法暫時無法用于大批量樣品的分析。導致檢測結果偏差的因素包括溶劑的選擇——樣品易溶解、能去除活潑氫干擾、與定量峰不重疊；內標的品質——含量準確、溶解性好、與目標物不重疊；定量峰的選擇——與內標物定量峰化學環(huán)境相近、不受旁邊峰的干擾[9]。

3.4對照品定值準確性是對照品的重要屬性，如何保證對照品量值準確性是對照品研究的一項重要工作。天士力研究院在自制對照品研究中做了很多努力，也積累了很多經驗。本文在采用國際通用的質量守衡法進行賦值的同時，進一步采用核磁共振定量法加以佐證，更好地保障了對照品的賦值準確性。但是作為一項極其嚴格的工作，不論是質量守恒法還是核磁共振定量法，都需要對檢測方法進行持續(xù)研究并進行方法學驗證，才能更好地保障賦值結果的可靠性。