植物根際促生細(xì)菌菌肥對(duì)新疆灰棗根際土壤解鉀效果及其與有機(jī)酸的相關(guān)性

朱舒亮， 劉勝亮， 李 靜， 楊 越， 楊文英， 李建貴

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)研究所，新疆烏魯木齊 830052； 2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)/新疆紅棗工程技術(shù)研究中心，新疆烏魯木齊 830052；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)2612團(tuán)隊(duì)，新疆烏魯木齊 830052)

植物根際促生細(xì)菌(plant growth-promoting rhizobacteria，簡(jiǎn)稱PGPR)是在植物根際系統(tǒng)定殖、能夠明顯促進(jìn)植物生長(zhǎng)或抑制病原菌活動(dòng)的一類有益細(xì)菌的總稱，具有普通土壤微生物的促進(jìn)有機(jī)質(zhì)分解與轉(zhuǎn)化、養(yǎng)分循環(huán)和吸收等作用[1-5]。

目前大量研究表明，PGPR能夠有效促進(jìn)植物根部生長(zhǎng)，為植物的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)需求。部分特定功能菌株通過生長(zhǎng)代謝作用還可以活化微生物生態(tài)環(huán)境。植物對(duì)土壤有效營(yíng)養(yǎng)成分的利用效率主要通過根部的生長(zhǎng)和根表面積的增加來反映[6-8]。將PGPR制備的菌肥施入土壤后，在土壤微生物及土壤酶活性影響下能分泌產(chǎn)生大量有機(jī)酸，土壤pH值呈下降趨勢(shì)，通過不斷釋放出土壤中的氮(N)、磷(P)、鉀(K)，不僅能夠有效提高根系的抗逆性，還能改善土壤的理化性質(zhì)[9]。因此，揭示以微生物、土壤、植物三者之間相互作用為核心內(nèi)容的根際動(dòng)態(tài)過程的作用機(jī)制，通過對(duì)根際生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)控，提高水分、養(yǎng)分資源的利用效率，控制和減少環(huán)境污染，是提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的一種新途徑，也將是未來生態(tài)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)一個(gè)新的發(fā)展方向[10-12]。

目前，人們?cè)诮饬拙凸痰南嚓P(guān)應(yīng)用技術(shù)上已經(jīng)有了較為成熟的方法和經(jīng)驗(yàn)，但在解鉀菌方面的技術(shù)較為薄弱，而耕作層土壤中含有大量固定態(tài)的鉀，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們?cè)絹碓阶⒅貙?duì)增加土壤鉀離子含量的需求?？茖W(xué)配比、合理施用鉀肥，以及補(bǔ)充土壤中的鉀素，已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[13-15]。

由于新疆地區(qū)地理?xiàng)l件特殊，土地普遍鹽堿成分含量較高，且新疆處于干旱半干旱地帶，這對(duì)于目前已有的大部分菌肥與制劑在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用產(chǎn)生了制約。因?yàn)槲⑸锲毡閷?duì)于生存環(huán)境較敏感，且具有一定的專一性。由于針對(duì)新疆地區(qū)特殊環(huán)境土壤的解鉀機(jī)制研究相對(duì)較少，所以，根據(jù)新疆地區(qū)獨(dú)特的氣候條件和土壤環(huán)境及灰棗的營(yíng)養(yǎng)需求，加上對(duì)解鉀細(xì)菌特性的了解，筆者用分離篩選的4株高效解鉀菌進(jìn)行田間試驗(yàn)，進(jìn)一步分析菌株分泌的有機(jī)酸對(duì)釋放土壤中速效鉀的效果，不僅可以提高鉀肥利用率，還能切實(shí)緩解我國(guó)對(duì)鉀肥產(chǎn)生的供應(yīng)與需求之間的矛盾，改良鹽堿地土壤肥力，保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，維持作物高產(chǎn)，降低對(duì)化肥的使用量與對(duì)環(huán)境的污染性，進(jìn)而保護(hù)我國(guó)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，對(duì)發(fā)展有機(jī)、生態(tài)、低碳農(nóng)業(yè)，以及保證糧食安全具有極其深遠(yuǎn)的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)地概況 新疆庫(kù)爾勒位于我國(guó)西北地區(qū)(地理位置85°12′～86°27′E，41°14′～42°14′N)，由霍拉山、天山形成了庫(kù)爾勒的北部屏障，南部為著名的塔克拉瑪干沙漠，可謂地理位置險(xiǎn)峻，是連接南北疆的樞紐。庫(kù)爾勒地區(qū)屬于溫帶大陸性氣候，光照條件充足，早晚溫差較大，且降水量稀少，該地區(qū)適合喜溫植物的種植生長(zhǎng)。

試驗(yàn)地位于庫(kù)爾勒市東北方位25 km處的新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)研究所博湖南山試驗(yàn)基地棗樹果園中，土壤質(zhì)地為沙壤土，日照時(shí)數(shù)為2 990 h，年平均降水量為58.6 mm，年平均溫度為12.1 ℃，土壤堿解氮含量為33.36 mg/kg，速效磷含量為16.34 mg/fig，速效鉀含量為55.36 mg/kg。土壤結(jié)構(gòu)較為多樣，其中沙壤土雜質(zhì)較多，有機(jī)物、P、K含量普遍不高。

1.1.2 供試菌株 本田間試驗(yàn)供試菌株為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)研究所微生物實(shí)驗(yàn)室經(jīng)篩選得出的解鉀能力較強(qiáng)的解鉀菌4株：K3、K7、K11、K24。

1.1.3 供試作物 供試果樹為六年生灰棗樹，并選擇東西方向種植，且樹齡、樹干直徑、樹形一致的作為試驗(yàn)處理小區(qū)樣株，樣株的種植密度(株行距)為1.5 m×2.5 m。

1.1.4 室內(nèi)擴(kuò)繁培養(yǎng) 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方：3.0 g牛肉膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，18.0 g瓊脂，pH值為7.0～7.2，1 000 mL蒸餾水。

對(duì)于經(jīng)過分離鑒定的解鉀菌株，取冷凍保存的菌種，經(jīng)過復(fù)蘇活化，在無抗平板上劃線，重復(fù)3次，于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，挑選培養(yǎng)皿內(nèi)培育的優(yōu)勢(shì)單菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min環(huán)境中擴(kuò)繁培養(yǎng)，擴(kuò)繁培養(yǎng)在室內(nèi)無菌條件下進(jìn)行。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組的試驗(yàn)方法，以保證試驗(yàn)的可靠性，共設(shè)置3個(gè)處理，處理1：各供試菌劑(K3、K7、K11、K24)+基肥；處理2：未接菌空白培養(yǎng)基+基肥；處理3：清水+基肥。2個(gè)對(duì)照為CK1(空白培養(yǎng)基)與CK0(清水空白)。

1.2.2 試驗(yàn)小區(qū)及重復(fù)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)成年果樹選擇樹齡相同、果樹株形與產(chǎn)量相對(duì)一致，且土壤地力差異性相對(duì)較小的果園地塊，共有6個(gè)處理，分別為處理1(K3菌株)、處理2(K7菌株)、處理3(K11)、處理4(K24菌株)、處理5(空白培養(yǎng)基對(duì)照)、處理6(清水空白對(duì)照)。每個(gè)處理各設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)各種4株果樹，合計(jì)18個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，共72株灰棗果樹，各個(gè)處理區(qū)組采用長(zhǎng)方形隨機(jī)排列，最好做到單灌單排，避免邊際效應(yīng)和各個(gè)處理間的相互影響。

1.2.3 灌根及回收采集 本試驗(yàn)于2016年4月底在灰棗果園中進(jìn)行，各處理菌液采用穴施法按200 mL/株澆施，澆施前用清水將原液稀釋到1 000 mL，施入棗樹正東方向(距樹干10～15 cm，土層深度為30 cm)，空白對(duì)照處理加入無菌空白液體培養(yǎng)基，而清水對(duì)照加等量清水。施菌后0、30、60、90、120 d采集土壤樣品，并將回收后的土壤風(fēng)干，進(jìn)行速效養(yǎng)分含量的測(cè)定。

1.3 土壤養(yǎng)分測(cè)定

對(duì)于試驗(yàn)用地取回的土樣，土壤微生物相關(guān)測(cè)定選用新鮮土樣，其他一般分析項(xiàng)目都采用風(fēng)干土樣。

1.3.1 土壤活菌數(shù)的測(cè)定 在本試驗(yàn)中用稀釋平板法進(jìn)行活菌數(shù)量的測(cè)定，雖然可以測(cè)定根際土壤中的活菌數(shù)量，但是因?yàn)樘镩g試驗(yàn)具有較多不可控性并受諸多因素制約，單純地使用計(jì)數(shù)結(jié)果不能準(zhǔn)確無誤地反映微生物的實(shí)際數(shù)量，因此，為了降低測(cè)定的誤差，對(duì)于采集的土壤樣品稀釋液每次都需要經(jīng)過充分的振蕩以保證混勻[16]。

在無菌環(huán)境下取根際土壤并稱量(10 g)后，一同溶于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，于28 ℃恒溫振蕩30 min，使微生物細(xì)胞充分分散。取0.5 mL 10-1稀釋液與4.5 mL無菌水混勻，即得10-2稀釋液；再取0.5 mL 10-2稀釋液與4.5 mL無菌水混勻，即得10-3稀釋液，將所制備的稀釋液均勻地涂布在含有利福平(300 μg/mL)的牛肉膏蛋白胨平板上，重復(fù)3次。在恒溫培養(yǎng)箱中于28 ℃培養(yǎng)2 d后進(jìn)行計(jì)數(shù)，培養(yǎng)結(jié)束后取出培養(yǎng)平板，對(duì)各個(gè)試驗(yàn)組的菌株發(fā)育情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)相同濃度培養(yǎng)皿上的有效菌落數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.2 土壤速效鉀含量的測(cè)定 土壤速效鉀含量測(cè)定方法：將采集的土樣風(fēng)干后，經(jīng)1 mm篩孔過濾后稱5 g土樣，倒入浸提瓶中，加1 mol/L乙酸銨溶液定容至50 mL，給浸提瓶口封膜加蓋后，于水浴恒溫振蕩器中振蕩30 min，用干濾紙進(jìn)行雜質(zhì)過濾，將濾液提取至試管中，各處理重復(fù)3次，使用火焰光度計(jì)測(cè)定速效鉀含量。

1.3.3 土壤有機(jī)酸含量的測(cè)定 土壤有機(jī)酸含量測(cè)定采用高效液相色譜法(HPLC)，用U3000高效液相色譜儀測(cè)定，色譜條件：C18色譜柱，250 mm×4.6 mm；流動(dòng)相：99% 0.02 moL/L KH2PO4和1%甲醇(用H3PO4調(diào)節(jié)pH值至 2.6)，流速：0.5 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。樣品處理：取10 mL發(fā)酵液樣品于離心管中，在離心機(jī)中于 4 000 r/min 離心10 min，離心后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，將濾液在超聲波清洗器上振蕩后，測(cè)定有機(jī)酸含量，重復(fù)3次。因有機(jī)酸分泌有時(shí)間的滯后性，所以施菌后1d開始采樣檢測(cè)灰棗根際土壤內(nèi)有機(jī)酸含量。

1.3.4 土壤pH值的測(cè)定 土壤pH值的測(cè)定方法：將采集的土樣風(fēng)干后經(jīng)1 mm篩孔過濾，稱取 20 g 土樣，倒入浸提瓶中，加入蒸餾水定容至50 mL，于水浴恒溫振蕩器上振蕩 3 min，用酸度計(jì)測(cè)定pH值，重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理使用Excel 2003，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度有機(jī)酸對(duì)礦物鉀釋放的影響

土壤的肥力與土壤供給植物生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)元素都與土壤養(yǎng)分有著直接關(guān)系[17-18]。在研究不同菌劑對(duì)灰棗根際土壤微生物數(shù)量的影響中，測(cè)得的土壤微生物菌落數(shù)是1個(gè)生長(zhǎng)周期的平均值。由表1可以看出，微生物菌株處理組在剛澆灌菌液(0 d)時(shí)，菌落數(shù)在1.0×1010CFU/g以上；在澆灌菌液30 d時(shí)，菌落數(shù)量降至1.0×107CFU/g以下；在澆灌菌液60～90 d時(shí)，菌落數(shù)維持在1.0×108CFU/g數(shù)量級(jí)，可見菌落數(shù)量變化不大，但4株菌株具有不同強(qiáng)弱的定殖效果；到澆灌菌液120 d時(shí)，菌落數(shù)量略有下降。其中K7菌株制備的菌液對(duì)土壤中的微生物數(shù)量具有較為平穩(wěn)和較強(qiáng)的增益效果，其他幾種處理菌有不同程度的表現(xiàn)。

2.2 PGPR對(duì)灰棗根際土壤中有機(jī)酸含量的影響

采用高效液相色譜法測(cè)定混合有機(jī)酸的標(biāo)樣，從而對(duì)土壤中有機(jī)酸含量進(jìn)行測(cè)定。由表2可以看出，不同菌肥施菌后經(jīng)過1 d分泌有機(jī)酸，與清水對(duì)照處理(CK0)對(duì)比后可以看出，施菌前土壤中的有機(jī)酸含量與施菌后無明顯差異，土樣中基本沒有檢測(cè)出有機(jī)酸含量；在施菌液30 d時(shí)，3種有機(jī)酸含量多數(shù)到達(dá)分泌的峰值， 土壤中丙酮酸的含量變化較為明顯，其中K7菌株的丙酮酸濃度達(dá)4.018 mg/kg，乙酸與檸檬酸在部分處理下均有增加，在隨后的60 d時(shí)逐漸下降，在90、120 d時(shí)趨于平穩(wěn)。說明土壤中分泌有機(jī)酸是有一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化趨勢(shì)的，與速效鉀含量變化趨勢(shì)相結(jié)合分析，說明土壤中的有機(jī)酸含量對(duì)含鉀礦物產(chǎn)生溶解釋放作用，并增加了土壤中植物可吸收利用的速效鉀含量。

表1 根際土壤微生物菌落計(jì)數(shù)

表2 根際土壤中的有機(jī)酸含量

2.3 PGPR對(duì)灰棗根際土壤中速效鉀含量的影響

由表3可知，在施入菌液1 d后，各菌劑處理組土壤中的速效鉀含量均高于對(duì)照組且與CK0之間差異顯著(P<0.05)，其中K3菌株的速效鉀含量達(dá)到了112.75 mg/kg，比清水對(duì)照的速效鉀含量高 45.2 mg/kg，各處理速效鉀含量比清水對(duì)照高40.39%～66.91%。在施入菌液30、60 d時(shí)，各處理土壤中的速效鉀含量均不同程度地高于對(duì)照，其中K7、K24菌株對(duì)土壤中速效鉀含量提升效果顯著；在施入菌液90 d 時(shí)，K3菌株速效鉀含量最高，其余菌株處理土壤中的速效鉀含量趨于平穩(wěn)，并接近對(duì)照。

觀察土壤中活菌數(shù)量可知，雖然活菌數(shù)量已有下降趨勢(shì)，但土壤中的PGPR仍具有一定的解鉀效用，因此可見，試驗(yàn)土壤中的速效鉀含量并沒有隨著活菌數(shù)的減少而下降，而且還有部分小區(qū)出現(xiàn)了速效鉀含量提高的現(xiàn)象。到施用菌液 120 d 時(shí)，隨著果實(shí)成熟期的到來，果實(shí)細(xì)胞分化，果實(shí)體積逐漸增大，土壤中的速效鉀逐漸流入棗果中，此時(shí)土壤中的速效鉀含量降低。說明在一定程度上，施用微生物菌液可以提高土壤中速效鉀的供給能力，施菌后1 d K24菌株對(duì)速效鉀含量的提升能力最佳，較CK0含量高37.24 mg/kg。

2.4 PGPR對(duì)灰棗根際土壤中pH值的影響

由圖1可以看出，土壤中的pH值隨著時(shí)間的推進(jìn)有一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化趨勢(shì)，因?yàn)榫暝诎l(fā)酵液中分泌有機(jī)酸，使得菌液pH值呈酸性，在施菌后1 d的土壤中的pH值最低。并且空白對(duì)照培養(yǎng)基的pH值初始為7.0～7.2，所以對(duì)比清水對(duì)照，也有一定差異。在30 d時(shí)，土壤中pH值提高，說明根際土壤吸收PGPR菌肥，相比CK產(chǎn)生一定的差異，在施菌后60、90 d時(shí)，pH值開始逐漸下降，其中K24菌株處理土壤pH值的變化明顯。在施菌后120 d時(shí)，pH值有所升高，說明PGPR經(jīng)過生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物，改善了鹽堿土地的酸堿度，作用于生長(zhǎng)期內(nèi)，但是隨著時(shí)間的變化，PGPR對(duì)土壤中pH值的改良功效有所減弱。

3 結(jié)論

本研究將制備的微生物菌液進(jìn)行田間試驗(yàn)，定期采樣并測(cè)定土壤中的速效鉀含量與有機(jī)酸種類、含量，進(jìn)一步分析有機(jī)酸對(duì)轉(zhuǎn)換土壤中鉀離子形態(tài)的作用。主要研究結(jié)果如下：

(1)通過對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的分析可知，不同菌劑處理微生物菌落數(shù)量均高于清水對(duì)照，在施菌后明顯高于清水對(duì)照，之后進(jìn)入一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程，其中K7菌株制備的菌液對(duì)土壤中微生物數(shù)量具有提高且平穩(wěn)的效果。

表3 不同處理根際土壤中的速效鉀含量

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

(2)通過前期對(duì)有機(jī)酸標(biāo)樣的測(cè)定，定期采樣檢測(cè)土樣后發(fā)現(xiàn)，因?yàn)樘镩g試驗(yàn)的不可控因素過多，有機(jī)酸含量普遍偏低，提取其中含量高的3種有機(jī)酸——丙酮酸、乙酸、檸檬酸進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤。3種有機(jī)酸含量多數(shù)在施菌后30 d時(shí)達(dá)到最高值，隨后逐漸下降并趨于平穩(wěn)。其中丙酮酸中K7菌株處理的濃度在施菌后30 d時(shí)最高，達(dá)4.018 mg/kg。

(3)不同菌劑施入后的土壤都具有提高土壤中鉀離子釋放量的作用，速效鉀含量均明顯高于對(duì)照，其中K3菌株處理的土壤中速效鉀含量達(dá)到了112.75 mg/kg，比CK0的速效鉀含量高45.2 mg/kg，不同菌株處理的速效鉀含量比CK0提高了40.39%～66.91%。K7、K24菌株處理與對(duì)照相比，在30、60 d時(shí)對(duì)土壤中速效鉀含量的提升效果明顯，K24菌株處理對(duì)土壤中礦物鉀的釋鉀能力最佳，施菌后1 d較清水對(duì)照含量高37.24 mg/kg。K3菌株處理在90 d時(shí)解鉀量最高，隨后降低并趨于平穩(wěn)。

4 討論

本研究結(jié)果表明，經(jīng)過1個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)的動(dòng)態(tài)測(cè)定，施用PGPR菌肥處理使得棗樹根際土壤中的速效鉀含量、有機(jī)酸含量、微生物數(shù)量比只施用常規(guī)化肥的對(duì)照明顯提高，但是由于田間試驗(yàn)的不可控性，有機(jī)酸的含量普遍偏低。土壤中接種PGPR可以顯著地改善作物的鉀素營(yíng)養(yǎng)，釋放生長(zhǎng)養(yǎng)分，改良土壤品質(zhì)，調(diào)節(jié)土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡[19-21]，其解鉀作用與生長(zhǎng)代謝過程中所產(chǎn)生的有機(jī)酸種類與含量密切相關(guān)。因?yàn)椴煌忖浘晏匦源嬖诓町?，?dǎo)致在生長(zhǎng)代謝過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸濃度、種類相差較大，所以不同高效解鉀菌之間在對(duì)鉀的活化能力上也存在較大差異[22]。

當(dāng)植物根際土壤中的有機(jī)酸含量較低時(shí)，有機(jī)酸的種類將在一定程度上決定對(duì)土壤中難溶性或不可溶性鉀的活化作用。丙酮酸、乙酸、檸檬酸在土壤中含量最高，對(duì)含鉀礦物中的鉀離子釋放也起到較為重要的作用。

綜上所述，不同菌株處理與只施用常規(guī)化肥的對(duì)照相比，施用了PGPR對(duì)土壤的肥力提高明顯，從而進(jìn)一步論證了PGPR可改良土壤環(huán)境、促進(jìn)植物對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收利用[23-24]。PGPR中的有機(jī)酸可有效地促進(jìn)礦物鉀的分解釋放，但有機(jī)酸對(duì)含鉀礦物的釋鉀是一個(gè)既緩慢又持續(xù)的綜合動(dòng)態(tài)過程，含鉀礦物的釋鉀量既受有機(jī)酸種類的影響，也與其濃度影響關(guān)系密切。由于微生物自身的局限性以及植株對(duì)養(yǎng)分變化表達(dá)的滯后性，需要增加試驗(yàn)點(diǎn)擴(kuò)大試驗(yàn)并對(duì)樣本進(jìn)行連續(xù)觀測(cè)，以期建立更完善的數(shù)據(jù)體系。進(jìn)一步的研究將有可能更深入地揭示與闡明高效解鉀菌的解鉀機(jī)制，這一點(diǎn)很值得關(guān)注。