外源噴施水楊酸對(duì)冬瓜枯萎病的防治效果及機(jī)制

李紅杰

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014109)

冬瓜(BenincasahispidaCogn.)屬葫蘆科冬瓜屬一年生植物，原產(chǎn)于我國(guó)南部和印度，富含多種人體所必需的礦質(zhì)元素和維生素，深受人們的喜愛(ài)，在我國(guó)已有2 000多年的栽培歷史[1-3]。近年來(lái)，隨著種植面積的不斷擴(kuò)大和連作年限的延長(zhǎng)，冬瓜病害問(wèn)題日益頻發(fā)，尤其是冬瓜枯萎病的發(fā)生逐年加重，已成為我國(guó)冬瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙因素之一[4]。冬瓜枯萎病是一種由尖刀鐮孢菌冬瓜專(zhuān)化型(FusariumoxysporumSchl. f.sp.benincasae)引起的土傳性真菌病害，可在冬瓜整個(gè)生育期內(nèi)進(jìn)行危害，輕則造成減產(chǎn)，重則導(dǎo)致絕收，給農(nóng)戶(hù)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。目前，前人在種質(zhì)資源抗性評(píng)價(jià)[6]、抗性遺傳規(guī)律[7]、分子標(biāo)記[8]及化學(xué)藥劑防治[9]等方面對(duì)冬瓜枯萎病展開(kāi)了相應(yīng)的研究，但是高抗枯萎病的冬瓜品種鮮見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道，而化學(xué)藥劑的防治效果也不甚理想。因此，高效的生物防治藥劑開(kāi)發(fā)已成為冬瓜生產(chǎn)中亟須解決的關(guān)鍵問(wèn)題。水楊酸是植物體內(nèi)的一類(lèi)小分子酚類(lèi)物質(zhì)，具有植物內(nèi)源信號(hào)分子功能，與植物的抗病性密切相關(guān)[10]。王錚等研究表明，外源噴施水楊酸可誘導(dǎo)煙草對(duì)斑萎病、花葉病、野火病及赤星病等產(chǎn)生抗性，可顯著減少農(nóng)藥的使用量[11]；薛仁風(fēng)等研究表明，水楊酸處理可誘導(dǎo)普通菜豆的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，簡(jiǎn)稱(chēng)PAL)活性、過(guò)氧化物酶活性、過(guò)氧化氫含量明顯升高，從而顯著提升普通菜豆對(duì)枯萎病的抗性[12]；石亞莉等研究表明，外源噴施水楊酸可顯著提升采后蘋(píng)果果肉組織的保護(hù)酶及病程相關(guān)蛋白活性，酚類(lèi)及類(lèi)黃酮物質(zhì)明顯積累，從而提高了采后蘋(píng)果對(duì)灰霉病的抗性[13]。然而，關(guān)于水楊酸對(duì)冬瓜枯萎病的影響尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以鐵柱999冬瓜品種為研究對(duì)象，研究外源噴施水楊酸對(duì)冬瓜枯萎病抗病性及相關(guān)生理生化指標(biāo)變化的影響，初步探討水楊酸對(duì)冬瓜枯萎病的抗性誘導(dǎo)機(jī)制，以期為水楊酸在冬瓜枯萎病防治方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試冬瓜品種為鐵柱999，購(gòu)自湖南省長(zhǎng)沙市銀田蔬菜種子實(shí)業(yè)有限公司；供試冬瓜枯萎病病原菌尖刀鐮孢菌(FusariumoxysporumSchl.)由筆者所在實(shí)驗(yàn)室自主分離、保存；供試水楊酸為分析純水楊酸，購(gòu)自生工生物(上海)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2017年3月20日在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院日光溫室內(nèi)穴盤(pán)育苗。4月5日選取長(zhǎng)勢(shì)一致的鐵柱999冬瓜幼苗150株，分別定植于40 cm×50 cm 的花盆中，栽培土壤為當(dāng)?shù)厝展鉁厥移胀ㄍ寥?，每盆定?株。試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)處理，即在定植后分別用濃度為50、100、150、200 mg/L 的水楊酸溶液進(jìn)行葉面噴施，每天噴施1次，10 mL/次，連續(xù)噴施3次，以噴施等量的無(wú)菌清水作為對(duì)照(CK)，每個(gè)處理10株，重復(fù)3次，共計(jì)150株。水楊酸連續(xù)3次噴施完成后，每株接種2.0×106CFU/g土的尖鐮孢菌。整個(gè)試驗(yàn)期間，給予各植株正常的水肥管理。

1.2.2 項(xiàng)目測(cè)定及方法 冬瓜枯萎病發(fā)病情況于接種后5 d開(kāi)始調(diào)查，每隔3 d調(diào)查1次，共調(diào)查6次，病情指數(shù)及防治效果計(jì)算按照趙仕光等的方法[14]進(jìn)行。生理生化指標(biāo)于接種前進(jìn)行第1次測(cè)定，第2次于接種后5 d進(jìn)行測(cè)定，之后每隔3 d測(cè)定1次，共測(cè)定6次。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡(jiǎn)稱(chēng)SOD)活性、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，簡(jiǎn)稱(chēng)PPO)活性、過(guò)氧化氫酶(catalase，簡(jiǎn)稱(chēng)CAT)活性及PAL活性測(cè)定分別采用抑制硝基四氮唑(NBT)光還原比色法、三氯乙酸比色法、紫外分光光度法和苯丙氨酸比色法進(jìn)行；幾丁質(zhì)酶(chitinase，簡(jiǎn)稱(chēng)CHT)活性測(cè)定采用徐恩靜等的方法[15]；β-1，3-葡聚糖酶(β-1，3-glucan，簡(jiǎn)稱(chēng)GLU)活性測(cè)定采用蔣選利等的方法[16]；H2O2含量測(cè)定采用高錳酸鉀法；丙二醛(malonic dialdehyde，簡(jiǎn)稱(chēng)MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理、計(jì)算及作圖采用Excel 2007軟件進(jìn)行，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源噴施水楊酸對(duì)冬瓜枯萎病的影響

由圖1-a可知，在整個(gè)試驗(yàn)期間，5種處理的冬瓜枯萎病病情指數(shù)均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。噴施相同時(shí)間時(shí)，150 mg/L外源水楊酸噴施處理的冬瓜病情指數(shù)始終最低，CK始終最高。在接種后20 d時(shí)，CK、50、100、150、200 mg/L 處理的病情指數(shù)分別達(dá)到62.15、42.05、35.18、28.25、31.33。假設(shè)CK對(duì)冬瓜枯萎病的防治效果為0，則4種不同濃度外源水楊酸噴施處理的防治效果依次為52.15%、60.16%、78.02%、67.78%。由圖1-b可知，150 mg/L 處理與50 mg/L處理達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)，與100 mg/L處理達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)。上述結(jié)果表明，外源噴施水楊酸可明顯降低冬瓜枯萎病病情指數(shù)，提升枯萎病防治效果，其中以濃度 150 mg/L 噴施效果最佳。

2.2 外源噴施水楊酸對(duì)冬瓜葉片SOD、PPO、CAT及PAL活性的影響

由圖2可見(jiàn)，在接種枯萎病病原菌后，5種處理下的冬瓜葉片SOD、PPO及PAL活性均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)。在整個(gè)試驗(yàn)期間，150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的SOD、PPO及PAL活性在同一時(shí)間點(diǎn)始終保持最高，并在接種后17 d活性達(dá)到最高，此時(shí)SOD活性分別較CK、50、100、200 mg/L處理提升82.33%、16.6%、10.25%、4.07%，PPO活性分別較CK、50、100、200 mg/L提升 73.22%、26.08%、15.07%、3.82%，PAL活性分別較CK、50、100、200 mg/L提升176.61%、28.06%、18.14%、6.03%，與CK及50 mg/L處理差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，與 100 mg/L 處理差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。CAT活性在外源噴施水楊酸處理下表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(shì)，在整個(gè)試驗(yàn)期間，150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的CAT活性始終保持最低，并在接種后17 d達(dá)到最低，分別較CK、50、100、200 mg/L處理降低34.42%、25.96%、17.72%、8.98%，與CK及50 mg/L處理差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，與 100 mg/L 處理差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。上述結(jié)果表明，外源噴施水楊酸可提升冬瓜葉片的SOD、PPO及PAL活性，降低CAT活性，以濃度150 mg/L處理效果最佳。

2.3 外源噴施水楊酸對(duì)冬瓜葉片CHT及GLU活性的影響

CHT和GLU是2個(gè)非常重要的病程相關(guān)蛋白，在植物抗病防御體系中發(fā)揮著非常重要的作用[17]。CHT屬于水解酶類(lèi)，主要通過(guò)水解真菌菌絲合成的幾丁質(zhì)抑制病原菌生長(zhǎng)[17]。外源噴施水楊酸對(duì)冬瓜葉片CHT活性的影響如圖 3-a 所示，外源噴施水楊酸可明顯提升冬瓜葉片的CHT活性，且CHT活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)。在整個(gè)試驗(yàn)期間，150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的CHT活性始終保持最高，并在接種后17 d達(dá)到最高，分別較CK、50、100、200 mg/L提升93.75%、14.72%、9.11%、4.75%，與CK及50 mg/L處理差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，與 100 mg/L 處理差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

GLU屬糖基水解酶類(lèi)，不僅可以通過(guò)水解真菌細(xì)胞壁的主要成分β-1，3-葡聚糖而抑制真菌生長(zhǎng)，而且可以間接誘導(dǎo)植物體內(nèi)植保素的積累，從而提高植物抗病性[17]。由圖 3-b 可見(jiàn)，外源噴施水楊酸可提升冬瓜葉片的GLU活性，同時(shí)，GLU活性隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。150 mg/L 外源水楊酸噴施處理下的GLU活性在整個(gè)試驗(yàn)期間始終保持最高，并在接種后17 d達(dá)到最高，分別較CK、50、100、200 mg/L提升254.57%、65.36%、47.62%、5.92%，與CK及50 mg/L處理差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，與 100 mg/L 處理差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。上述結(jié)果表明，外源噴施水楊酸可提升冬瓜葉片的CHT及GLU活性，以濃度 150 mg/L 處理效果最佳。

2.4 外源噴施水楊酸對(duì)冬瓜葉片H2O2及MDA含量的影響

H2O2不僅是植物體內(nèi)的活性氧，同時(shí)更是抗病反應(yīng)中的重要信號(hào)分子，在植物抗病反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[18]。由圖4-a可知，外源噴施水楊酸可促進(jìn)H2O2在冬瓜葉片中的積累。在接種枯萎病病原菌后，5種處理下的冬瓜葉片中H2O2含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)。在整個(gè)試驗(yàn)期間，150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的H2O2含量始終保持最高，并在接種后17 d含量達(dá)到最高，分別較CK、50、100、200 mg/L提升44.08%、15.27%、10.11%、2.82%，與CK及50 mg/L處理差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，與 100 mg/L 處理差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。說(shuō)明，外源噴施水楊酸可促進(jìn)H2O2在冬瓜葉片中的積累，以濃度 150 mg/L 噴施時(shí)H2O2含量最高。

MDA含量是衡量膜質(zhì)過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)[19]。由圖4-b可見(jiàn)，外源噴施水楊酸可降低冬瓜葉片的MDA含量，且MDA含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢(shì)。150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的MDA含量在整個(gè)試驗(yàn)期間始終保持最低，在接種后20 d達(dá)到最高，MDA含量分別較CK、50、100、200 mg/L 降低37.3%、20.14%、13.24%、6.53%，與CK及50 mg/L處理差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，與100 mg/L處理差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。上述結(jié)果表明，外源噴施水楊酸可降低冬瓜葉片中的MDA含量，以濃度150 mg/L噴施MDA含量最低，膜脂過(guò)氧化程度最輕。

3 結(jié)論與討論

水楊酸作為植物重要的內(nèi)源信號(hào)分子，在植物抗病體系中發(fā)揮著重要的作用[10]。本研究結(jié)果表明，外源噴施水楊酸可降低冬瓜枯萎病病情指數(shù)，提升冬瓜枯萎病防治效果，且效果因噴施濃度大小而異， 以濃度150 mg/L噴施效果最佳， 冬瓜枯萎病防治效果達(dá)到78.02%。本研究結(jié)果與王錚等在煙草方面[11]、薛仁風(fēng)等在普通菜豆方面[12]及石亞莉等在采后蘋(píng)果方面[13]的研究結(jié)果較為一致，可能是由于外源噴施水楊酸可提升植物的防御酶及病程相關(guān)蛋白酶活性，進(jìn)而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性。

植物自身?yè)碛幸惶淄暾姆烙赶到y(tǒng)，以抵御生物和非生物逆境對(duì)自身造成的傷害[18]。本研究結(jié)果表明，外源噴施水楊酸可提升冬瓜葉片的SOD、PPO及PAL活性，降低CAT活性。以濃度150 mg/L處理效果最優(yōu)，接種后17 d冬瓜葉片的SOD、PPO及PAL活性分別較CK提升82.33%、73.22%、176.61%，CAT活性較CK降低34.42%，均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)；本研究結(jié)果與王錚等在煙草方面[11]、薛仁風(fēng)等在普通菜豆方面[12]及石亞莉等在采后蘋(píng)果方面[13]的研究結(jié)果較為一致。

CHT和GLU是2個(gè)非常重要的病程相關(guān)蛋白，在植物抗病防御體系中發(fā)揮著重要的作用[17]。本研究結(jié)果表明，外源噴施水楊酸可提升冬瓜葉片的CHT和GLU活性。在整個(gè)試驗(yàn)期間，150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的CHT及GLU活性始終保持最高，接種后17 d冬瓜葉片的CHT及GLU活性分別較CK提升93.75%、254.57%，均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)，本研究結(jié)果與石亞莉等在采后蘋(píng)果方面的研究結(jié)果[13]較為一致。

H2O2是植物抗病反應(yīng)中的重要信號(hào)分子，與植物抗病性密切相關(guān)[19-20]。本研究結(jié)果表明，外源噴施水楊酸可促進(jìn)H2O2在冬瓜葉片中的積累。在整個(gè)試驗(yàn)期間，150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的H2O2含量始終保持最高，并在接種后17 d含量達(dá)到最高，較CK提升44.08%，達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)，本研究結(jié)果與苑智華在東方百合方面[21]、薛仁風(fēng)等在普通菜豆方面[12]及馬玄等在杏方面[20]的研究結(jié)果較為一致，其原因可能是CAT是分解過(guò)氧化氫的關(guān)鍵酶，而外源噴施水楊酸可顯著降低植物的CAT活性，進(jìn)而導(dǎo)致過(guò)氧化氫在植物體內(nèi)積累，提高抗病性。

MDA含量是衡量膜脂過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)[19]。本研究結(jié)果表明，外源噴施水楊酸可降低冬瓜葉片的MDA含量，150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的MDA含量在整個(gè)試驗(yàn)期間始終保持最低，在接種后20 d MDA含量達(dá)到最高，較CK降低37.3%，達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)，其原因可能是150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的冬瓜葉片防御酶活性最高，因此膜脂過(guò)氧化程度最輕，MDA含量最低。

綜上所述，外源噴施水楊酸可提升冬瓜對(duì)枯萎病的防治效果，以濃度150 mg/L處理效果最佳，其機(jī)制可能是外源噴施水楊酸可誘導(dǎo)冬瓜葉片的防御酶活性(SOD、PPO、PAL)和病程相關(guān)蛋白酶活性(CHT、GLU)上升，CAT活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致H2O2積累和膜脂過(guò)氧化程度降低，從而提升冬瓜枯萎病抗性。