星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化清石顆粒醇提工藝

崔亞玲，趙慶春，馬宏達(dá)，岳 晶，胡 北，李 昕

0 引言

清石顆粒主要由海金沙、石韋、厚樸、茯苓、萹蓄、茵陳、澤瀉、瞿麥、白茅根、大腹皮、黃芪、烏藥、炙甘草提取精制而成，具有清熱涼血、利濕通淋、排石止痛的功效，主要用于治療泌尿系結(jié)石，其療效顯著，在我院泌尿外科臨床應(yīng)用多年。本研究對(duì)厚樸、烏藥、澤瀉選用乙醇提取，采用單因素考察和星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法，以厚樸酚、和厚樸酚的含量及出膏率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選清石顆粒醇提工藝，為其工業(yè)化大生產(chǎn)制備無糖型顆粒制劑提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(LC-19AD型，Japan Shimadzu)；色譜工作站N2000(浙江大學(xué)智能信息工程研究所)；KQ3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-D4恒溫水浴鍋(金壇市雙捷試驗(yàn)儀器廠)；電子分析天平AUW120D(北京島津公司)。

1.2 試藥 厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)：110729-200412)、和厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)：110730-201313)均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司)；甲醇(分析純，天津博迪化工股份有限公司)；乙酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；95%乙醇(分析純，盤錦天源藥業(yè)有限公司)；重蒸水(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院自制)；厚樸(批號(hào)：20131208)、烏藥(批號(hào)：20140405)、澤瀉(批號(hào)：20131209)，安國市童鈴藥材有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Welchrom C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱；以甲醇-0.5%冰醋酸溶液(75∶25)為流動(dòng)相[1]。

2.1.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取和厚樸酚及厚樸酚對(duì)照品，加甲醇溶解并制成含厚樸酚、和厚樸酚各20 μg/ml的混合溶液，即對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品稠膏約0.08 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇100 ml，密塞稱重，超聲處理20 min，放冷恢復(fù)至室溫后再次稱重，減少的重量加入甲醇補(bǔ)足，搖晃均勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性(除厚樸)樣品溶液的制備 按制劑處方配比稱取除厚樸外的其他12味藥材，按處方工藝制備成陰性樣品，按“2.1.3”項(xiàng)供試品溶液制備方法，制得陰性樣品溶液。

2.1.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取陰性(除厚樸)樣品溶液，厚樸酚、和厚樸酚混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μl，進(jìn)行色譜分析，結(jié)果表明，陰性樣品不干擾厚樸酚、和厚樸酚的測(cè)定，厚樸酚、和厚樸酚與其他成分或雜質(zhì)分離良好，結(jié)果見圖1。

圖1 厚樸酚及和厚樸酚專屬性圖譜

2.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系考察 精密吸取濃度為2.5、5、10、20、40、80 μg/ml的厚樸酚、和厚樸酚混合對(duì)照品溶液各20 μl，進(jìn)行色譜分析，橫坐標(biāo)為對(duì)照品濃度(μg/ml)，縱坐標(biāo)為峰面積值，求得回歸方程：Y厚樸酚=20 162 X+12 648，r=0.999 9；Y和厚樸酚=20 962 X+13 270，r=0.999 9。結(jié)果表明，厚樸酚、和厚樸酚在2.5～80 μg/ml范圍內(nèi)均與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取20 μl濃度為20 μg/ml的厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得厚樸酚峰面積及和厚樸酚峰面積的RSD分別為0.64%、0.61%(n=6)，表明該儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液20 μl，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件分析，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)行色譜分析，測(cè)得厚樸酚峰、和厚樸酚峰面積的RSD均為2.52%(n=6)，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 重復(fù)性、回收率試驗(yàn) 按相關(guān)方法操作，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品中厚樸酚及和厚樸酚平均含量分別為20.85、11.06 mg/g，RSD分別為2.64%、2.88%(n=6)；厚樸酚的平均回收率為96.9%，RSD為2.38%(n=6)，和厚樸酚的平均回收率為100.1%，RSD為2.44%(n=6)，均符合要求。

2.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法試驗(yàn)

2.2.1 提取次數(shù)的選擇 采用乙醇回流法制備厚樸、烏藥、澤瀉的提取物稠膏，乙醇濃度、溶劑用量、提取時(shí)間和提取次數(shù)是影響該法提取的主要因素。由于提取次數(shù)是非連續(xù)變量，不適用于星點(diǎn)設(shè)計(jì)分析，故對(duì)提取次數(shù)進(jìn)行單因素考察[2-3]。

按處方取厚樸、烏藥、澤瀉藥材3份，分別置于圓底燒瓶中，加入10倍量80%乙醇回流提取1 h，分別提取1、2、3次，濾過，取濾液，加熱濃縮至恒重，制得稠膏，按“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得供試品溶液，并進(jìn)行色譜分析，厚樸酚、和厚樸酚含量測(cè)定結(jié)果見表1。結(jié)果表明，提取次數(shù)為1次時(shí)，出膏率最低，厚樸酚、和厚樸酚含量最高，故將提取次數(shù)定為1次。

表1 不同提取次數(shù)對(duì)出膏率及厚樸酚、和厚樸酚含量的影響(n=3)

2.2.2 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，選取乙醇濃度、提取時(shí)間、溶劑用量為考察因素，每因素設(shè)5個(gè)水平，用代碼值-α、-1、0、1、α(α=1.682)表示，因素水平表見表2。分別按星點(diǎn)設(shè)計(jì)的因素安排試驗(yàn)，以出膏率、厚樸酚及和厚樸酚總含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并將這兩個(gè)指標(biāo)用Hassan方法標(biāo)為0～1之間的“歸一值”，以各指標(biāo)“歸一值”計(jì)算幾何平均數(shù)，得總評(píng)“歸一值”(總評(píng)OD值)[4]。試驗(yàn)安排見表3。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素與水平

由表4方差分析結(jié)果可知，二次多項(xiàng)式方程的P值<0.001，相關(guān)系數(shù)R2=0.940 2，說明方程擬合度良好，失擬項(xiàng)P=0.60>0.05，表明該模型能夠較好且誤差較小地反映響應(yīng)值的變化。且該模型中，X1(乙醇濃度)、X2(提取時(shí)間)對(duì)醇提工藝的提取得率有顯著影響(P<0.01)，綜上所述，此模型具有顯著的擬合度和預(yù)測(cè)性，因此，該模型可用于對(duì)清石顆粒的醇提工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.2.4 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè) 根據(jù)優(yōu)化后的二項(xiàng)式擬合方程，在保持1個(gè)因素編碼值為0時(shí)，應(yīng)用Design-expert 8.0.6軟件繪制其他2個(gè)因素與響應(yīng)值關(guān)系的三維效應(yīng)面圖，結(jié)果見圖2～圖4。基于上述擬合所建立的數(shù)學(xué)模型，得到最佳提取條件為7.22倍量73.92%乙醇回流提取84.32 min。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，本試驗(yàn)最終選取的工藝條件為7倍量75%乙醇回流提取90 min。

表3 醇提工藝星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排及結(jié)果

注：15～19號(hào)為重復(fù)性試驗(yàn)

表4 二次多項(xiàng)回歸方程方差分析結(jié)果

2.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方配比稱取藥材(n=3)，依據(jù)上述預(yù)測(cè)的最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果其總評(píng)OD值分別為0.898 7、0.883 2、0.911 2，而預(yù)測(cè)總評(píng)OD值為0.905 8，偏差率為-0.00 894%，說明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，可用于清石顆粒醇提工藝的優(yōu)化。

3 討論

3.1 在厚樸酚、和厚樸酚的含量測(cè)定方法學(xué)建立中，筆者對(duì)流動(dòng)相甲醇-水(78∶22)、甲醇-0.5%冰醋酸溶液(75∶25)、甲醇-水-1%冰醋酸溶液(75∶25)進(jìn)行了考察[5-6]。結(jié)果顯示，以甲醇-水(78∶22)為流動(dòng)相時(shí)，峰形不佳，且陰性有干擾。為改善峰形及分離效果，在2010版《中國藥典》一部厚樸藥材的含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件的基礎(chǔ)上，筆者調(diào)節(jié)甲醇、水的比例，并加入低比例醋酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相的離子強(qiáng)度。結(jié)果表明，以甲醇-0.5%冰醋酸溶液(75∶25)、甲醇-1%冰醋酸溶液(75∶25)為流動(dòng)相時(shí)，峰形理想，且陰性無干擾。為免色譜柱鍵合相受損壞而降低柱效，故選用甲醇-0.5%冰醋酸溶液(75∶25)為流動(dòng)相。

3.2 目前，相對(duì)于國內(nèi)應(yīng)用較為成熟的均勻設(shè)計(jì)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法能更好地解決試驗(yàn)精度不夠、條件優(yōu)選不能靈敏地考察各因素間的交互作用等問題，且因其具有可旋轉(zhuǎn)性及均勻精度性，使其作為一種新型的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，在藥學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮顯著成效[7-8]。因此，本研究選用星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)化清石顆粒醇提工藝，以乙醇濃度、提取時(shí)間、溶劑用量為考察因素，厚樸酚、和厚樸酚的含量及出膏率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，并采用歸一化幾何平均數(shù)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，消除了因各評(píng)價(jià)指標(biāo)單位或量綱不同所帶來的影響[9]，利用軟件建立數(shù)學(xué)模型，繪制三維效應(yīng)曲面關(guān)系圖，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證最佳工藝條件，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

圖2 乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)醇提工藝影響的三維效應(yīng)曲面圖

圖3 乙醇濃度和溶劑用量對(duì)醇提工藝影響的三維效應(yīng)曲面圖

圖4 提取時(shí)間和溶劑用量對(duì)醇提工藝影響的三維效應(yīng)曲面圖