吉馬酮對(duì)人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞系增殖、凋亡的影響

張洪海

0 引言

近年來(lái)，抗腫瘤新藥的研究已經(jīng)成為腫瘤研究的新熱點(diǎn)，其中天然化合物因其高效低毒的特性在腫瘤藥物治療研究中日益受到關(guān)注[1-4]。莪術(shù)油提取于姜科植物蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)、溫郁金的干燥根莖中，目前研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗病毒、抗炎及治療潰瘍等功效[5-7]。吉馬酮(Germacrone)是莪術(shù)油的主要有效成分之一，是一種單環(huán)倍半萜類天然化合物。近年來(lái)的藥物研究發(fā)現(xiàn)，吉馬酮具有明顯的抗腫瘤作用，對(duì)肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用，并且具備低毒高效等特點(diǎn)[8-9]，但其在肺癌中的相關(guān)抗腫瘤研究并不多，且抗腫瘤作用機(jī)制不完全明確。本研究通過(guò)培養(yǎng)人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞進(jìn)行吉馬酮的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，目的是明確吉馬酮對(duì)人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞是否有抑制作用，并通過(guò)熒光電子顯微鏡及流式細(xì)胞儀等實(shí)驗(yàn)研究方法對(duì)其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；吉馬酮：中國(guó)藥品生物制品檢定所；RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清：美國(guó)GIBCO公司；0.25%胰蛋白酶：美國(guó)康寧公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)：南京凱基公司；二甲基亞楓(DMSO)：南京凱基公司； AnnexinV/PI雙染試劑盒：南京凱基公司；流式細(xì)胞儀:美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NCI-H460細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37 ℃、飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng),每48小時(shí)胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 消化并收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H460細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整濃度至1×105/ml，96孔板中每孔接種100 μl細(xì)胞懸液，待過(guò)夜貼壁良好后更換培養(yǎng)液，依次加入含濃度為50、100、200、400 μmol/L吉馬酮的培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)有對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加MTT 20 μl，再培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μl振蕩混勻，酶標(biāo)儀檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 熒光顯微鏡觀察NCI-H460細(xì)胞形態(tài) 消化并收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整濃度至5×105/ml，6孔板中每孔接種2 ml細(xì)胞懸液，待過(guò)夜貼壁良好后更換培養(yǎng)液，依次加入含濃度為0、400 μmol/L吉馬酮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS洗2次，吹干，固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)固定15 min，PBS洗后加入濃度為5 mg/L的Hoechst 33342溶液1 ml，37 ℃避光15 min，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察并照相，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 消化并收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整濃度至5×105/ml，6孔板中每孔接種2 ml細(xì)胞懸液，待過(guò)夜貼壁良好后更換培養(yǎng)液，依次加入含濃度為0、200、400 μmol/L吉馬酮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。消化收集細(xì)胞后4 ℃、1 000 r/min離心10 min，PBS洗滌離心細(xì)胞2次。1×Binding Buffer 500 μl懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。5 μl AnnexinV-FITC加入細(xì)胞懸浮液中混勻，再加入5 μl PI混勻避光15 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吉馬酮對(duì)NCI-H460細(xì)胞增殖的影響 MTT實(shí)驗(yàn)顯示，吉馬酮可以抑制NCI-H460細(xì)胞的增殖，并且隨著吉馬酮濃度的增大對(duì)細(xì)胞的抑制作用更加明顯，呈濃度效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)(圖1)。

2.2 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡改變 熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，吉馬酮作用組的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞核的形態(tài)變化顯著，出現(xiàn)染色質(zhì)邊集、核碎裂等凋亡改變(圖2)。

圖1 吉馬酮對(duì)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H460細(xì)胞增殖的抑制作用

圖2 熒光顯微鏡觀察NCI-H460細(xì)胞凋亡形態(tài)改變

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著藥物濃度的增大，凋亡細(xì)胞的比例逐漸增加，呈現(xiàn)濃度效應(yīng)關(guān)系。見圖3。

3 討論

目前，肺癌仍占惡性腫瘤患者死亡率的首位。近年來(lái)，人們采取了化學(xué)治療等來(lái)治療中晚期肺癌，但由于化療的毒副作用及耐藥等問(wèn)題，對(duì)肺癌生存率的提高影響較小[10]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，一些天然化合物具有抗腫瘤作用，并表現(xiàn)出低毒高效等特點(diǎn)，目前在腫瘤治療研究中已受到重視[1-4]。天然化合物的抗腫瘤作用是目前肺癌治療研究的重要內(nèi)容之一。

圖3 吉馬酮誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡

本研究選取的天然化合物吉馬酮是從中藥姜科姜黃屬植物莪術(shù)根莖中提取的天然化學(xué)成分，具有抗病毒、抗炎、抗菌等藥理作用[11-12]。近年來(lái)的藥理實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，吉馬酮具有明顯的抗腫瘤作用，對(duì)肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，并且具備低毒高效等特點(diǎn)[8-9]。但吉馬酮在肺癌中的相關(guān)抗腫瘤研究并不多，且抗腫瘤作用機(jī)制不完全明確。本研究通過(guò)培養(yǎng)人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞進(jìn)行體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，通過(guò)MTT、熒光電子顯微鏡及流式細(xì)胞儀等實(shí)驗(yàn)研究方法研究吉馬酮對(duì)人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞的抑制作用及其抗腫瘤機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，吉馬酮可以抑制人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H460細(xì)胞的增殖，并呈濃度依賴關(guān)系。熒光顯微鏡觀察到藥物作用組細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)邊集、核碎裂等凋亡改變，流式細(xì)胞儀檢測(cè)到，隨著藥物濃度的增加，凋亡率隨之增大，證實(shí)了吉馬酮對(duì)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞有抑制作用，其機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，吉馬酮對(duì)人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞有明顯的抑制作用，為吉馬酮在治療大細(xì)胞肺癌方面提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但仍需動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，以進(jìn)一步評(píng)估其體內(nèi)抗腫瘤效果。