一點紅對STZ致2型糖尿病大鼠腎臟保護作用機制研究

馮協(xié)和，李 聰，王 珊，劉 菁

0 引言

近年來，作為糖尿病的主要并發(fā)癥之一，糖尿病腎病的發(fā)病率升高[1]。糖尿病腎病的腎臟損害包括內(nèi)部的腎小管、腎小球、腎間質(zhì)以及內(nèi)部血管病變等，隨著病變程度的加重，最終會導致腎臟纖維化乃至腎衰竭[2]。目前，糖尿病腎病的發(fā)病機制尚不明確，其發(fā)病可能是由代謝紊亂、細胞生長因子、遺傳和氧化應激等多因素綜合作用的結(jié)果[3]，因此，如何延緩糖尿病腎病的進展越來越受到關注。有報道，糖尿病腎病的特點是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-7)的表達下降和腎小球足細胞數(shù)目和分化降低，同時，伴隨體內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的表達增強[4]。有報道，BMP-7可以逆轉(zhuǎn)TGF-β1介導的腎小管上皮細胞分化，從而改善腎功能，抑制腎纖維化[5]。一點紅為菊科植物一點紅Emiliasonchifolia(L.) DC的全草，味苦、性涼，具有清熱解毒、散瘀消腫的作用，主治上呼吸道感染、口腔潰瘍、肺炎、乳腺炎、腸炎、菌痢、尿路感染、瘡癤癰腫、濕疹、跌打損傷等[6]。研究表明，其可以降低鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠的血糖，改善氧化應激，糾正糖脂代謝紊亂，保護胰島細胞[7]。本實驗進一步研究一點紅對STZ致糖尿病大鼠腎臟的保護作用，及其對腎組織中TGF-β1和BMP-7表達的影響，探討一點紅對糖尿病模型大鼠腎臟保護作用的機制，為降糖新藥制劑的開發(fā)及后期的臨床應用奠定基礎。

1 材料

1.1 藥材與試劑 一點紅購自神農(nóng)本草中藥飲片有限公司。厄貝沙坦片[安博維APROVEL，0.15 g，賽諾菲(杭州)制藥有限公司，國藥準字J20130049]；鏈脲佐菌素(美國Sigma公司，批號：SLBB8126V)；血糖試紙條(美迪信，批號：SPF16Z5B3)；TGF-β1、BMP-7免疫組化試劑盒(上海藍基生物科技有限公司)。其余試劑均為分析純。

1.2 動物 6～7周齡清潔級SD大鼠60只，雄性，體重220～240 g，由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(湘)2009-0004。飼養(yǎng)室溫度及相對濕度適宜，并且給予12 h光照和黑暗循環(huán)。自由攝食和飲水，適應性飼養(yǎng)7 d后用于實驗。

1.3 儀器 BS2202S電子天平(Sartorius儀器公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，超純水系統(tǒng)(南京集水環(huán)?？萍?，美迪信血糖儀(天津億朋醫(yī)療器械有限公司)，全自動生化分析儀(南京普朗生物技術有限公司)，Sigma離心機(美國Sigma公司)，顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社BX51)，切片機(德國徠卡)。

2 方法

2.1 供試品的制備 稱取1 kg一點紅藥材置10 L 的圓底燒瓶中，加入6 L純化水，加熱回流提取2 h，過濾取續(xù)濾液，在45 ℃下減壓濃縮為黑色浸膏，冰箱冷凍儲存，使用時采用純化水溶解稀釋至所需灌胃量。

2.2 2型糖尿病大鼠模型建立及分組 從適應性喂養(yǎng)7 d后的60只大鼠中，隨機選擇10只大鼠作為正常對照組，其余50只作為糖尿病造模動物。正常對照組大鼠用正常普通飼料喂養(yǎng)，模型組用高糖高脂飼料喂養(yǎng)2周后，禁食12 h，腹腔注射鏈脲佐菌素溶液(35 mg/kg)進行造模。高脂高糖飼料繼續(xù)飼養(yǎng)1周，禁食12 h，尾靜脈采血測定大鼠空腹血糖(FBG)，以FBG≥16.7 mmol/L為2型糖尿病大鼠造模成功[8]，造模成功率為72%。從造模成功的糖尿病大鼠中選取體重和血糖相當?shù)?0只，分別作為模型組、厄貝沙坦組、一點紅提取物組，每組10只，模型組觀察期間死亡2只，余8只繼續(xù)進行實驗。

2.3 給藥方法 根據(jù)分組情況，厄貝沙坦組給予厄貝沙坦0.015 8 g/kg進行灌胃(按人體每日服用0.15 g轉(zhuǎn)化為大鼠用量所得)，一點紅提取物組按10 g/kg進行灌胃，正常對照組和模型組均給予等體積的純化水進行灌胃。各組大鼠均每日灌胃1次，給藥4周。實驗期間均給予標準飼料喂養(yǎng)，不給予胰島素及其他降血糖干預。

2.4 觀察指標

2.4.1 一般狀況觀察 對大鼠的一般狀況(精神狀態(tài)、活動情況、體重、毛色、進食、飲水、排泄等)進行觀察。

2.4.2 各組大鼠24 h的飲食量、飲水量及尿量記錄 在實驗結(jié)束的前1 d,記錄各組大鼠24 h的飲食量和飲水量，采用代謝籠法收集24 h的尿液并記錄。

2.4.3 各組大鼠尿液生化指標的測定 將實驗結(jié)束前1 d收集的各組大鼠的尿液，取1 ml置1.5 ml的EP管中，3 000 r/min 離心5 min后得上清液，將上清液置自動生化測定儀中測定24 h尿蛋白總量(UPro)、24 h尿白蛋白總量(UAlb)、尿肌酐(Ucr)，采用冰點滲透壓測定儀測定尿液滲透壓(UOP)。

2.4.4 各組大鼠血液生化指標的測定 取全血經(jīng)3 000 r/min離心機離心得血清，用全自動生化分析儀測定血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、尿酸(UA)、白蛋白(Alb)和三酰甘油(TG)，采用無創(chuàng)尾動脈血壓測量系統(tǒng)檢測大鼠尾動脈收縮血壓。

2.4.5 各組大鼠體重和腎臟肥大指數(shù)的測定 各組大鼠在末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，稱重后用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射，麻醉大鼠后處死，迅速切取雙腎，濾紙吸干血液，天平精確稱重，計算腎臟肥大指數(shù)(Kidney hypertrophy index，KI)：KI=(腎重/體重)×100%。取部分留待腎組織病理切片和免疫組化用，其余裝于凍存管中，放置-80 ℃冰箱保存。

2.4.6 各組大鼠腎臟病理切片染色檢查 取腎組織置于10%中性甲醛固定液中24 h，分別用流水充分沖洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，常規(guī)病理切片，制成2 μm石蠟切片，HE、PAS染色于光鏡下觀察。

2.4.7 各組大鼠腎組織中TGF-β1和BMP-7免疫組化檢測 取部分腎組織置于10%中性甲醛固定液中48 h，分別用流水充分沖洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，常規(guī)病理切片，制成4 μm石蠟切片，70 ℃烘4 h，脫蠟入水，抗原熱修復，清除內(nèi)源性過氧化酶，滴加山羊血清封閉，分別滴加2個抗體，孵化后4 ℃過夜，在切片上滴加生物素二抗，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，水洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹脂封片。陽性為出現(xiàn)棕黃色著色。每個切片含10個高倍視野(400×)，采用Image pro plus 6.0軟件做半定量分析，用平均吸光度值(累積吸光度/測量面積)表示TGF-β1和BMP-7的表達。

3 結(jié)果

3.1 一般狀況觀察 正常對照組大鼠飲水和進食均比較正常，精神狀態(tài)良好，反應靈敏，皮毛光澤，體重增長，無死亡；模型組大鼠反應遲鈍，皮毛雜亂無光澤，體重下降，排尿增多，每日均需更換墊料，糞便稀，且飲食量和飲水量明顯增加，實驗期間有2例死亡，可能是高血糖使多臟器衰竭致死；厄貝沙坦組與一點紅提取物組大鼠飲食、飲水和排泄情況較模型組均有所改善，毛色尚可，反應能力明顯增強，活動量有所增加，觀察期間均無死亡。

3.2 各組大鼠24 h飲食量、飲水量及尿量比較 與正常對照組比較，模型組、厄貝沙坦組、一點紅提取物組大鼠24 h的飲食量、飲水量及尿量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，厄貝沙坦組和一點紅提取物組大鼠24 h的飲食量、飲水量及尿量均顯著降低(P<0.05)；一點紅提取物組大鼠24 h的飲食量、飲水量及尿量與厄貝沙坦組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

3.3 各組大鼠尿液中UPro、UAlb、Ucr及尿液滲透壓比較 與正常對照組比較，模型組、厄貝沙坦組、一點紅提取物組大鼠尿液中UPro、UAlb、Ucr均顯著升高(P<0.05)，UOP顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，厄貝沙坦組和一點紅提取物組大鼠尿液中UPro、UAlb、Ucr均顯著降低(P<0.05)，UOP顯著升高(P<0.05)；一點紅提取物組大鼠尿液中UPro、UAlb、UOP與厄貝沙坦組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但尿液中Ucr顯著高于厄貝沙坦組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠24 h飲食量、飲水量、尿量比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.4 各組大鼠血液中BUN、Scr、UA、Alb、TG、SBP比較 與正常對照組比較，模型組、厄貝沙坦組、一點紅提取物組大鼠血液中BUN、UA、TG及血壓均顯著升高(P<0.05)，僅模型組的Scr較正常對照組顯著升高(P<0.05)，厄貝沙坦組、一點紅提取物組的Scr與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，厄貝沙坦組、一點紅提取物組大鼠血液中BUN、Scr、UA、TG及SBP均顯著降低(P<0.05)；與厄貝沙坦組比較，一點紅提取物組僅TG顯著降低(P<0.05)，其他指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；四組間Alb比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

3.5 各組大鼠體重和腎臟肥大指數(shù)比較 模型組、厄貝沙坦組、一點紅提取物組大鼠的體重顯著低于正常對照組(P<0.05)，而腎重、KI顯著高于正常對照組(P<0.05)；與模型組比較，厄貝沙坦組和一點紅提取物組大鼠的體重顯著升高(P<0.05)，腎重、KI顯著降低(P<0.05)；一點紅提取物組大鼠的體重、腎重和腎臟肥大指數(shù)與厄貝沙坦組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

3.6 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學觀察 通過HE、PAS染色發(fā)現(xiàn)，正常對照組大鼠的腎臟組織中腎小球血管清晰，形態(tài)規(guī)則，內(nèi)皮細胞和系膜細胞數(shù)目正常，無其他明顯病變；與正常對照組相比，模型組有明顯病變發(fā)生，腎間質(zhì)有炎性細胞浸潤，血管充血擴張，腎小球肥大，其內(nèi)皮細胞腫脹、系膜細胞增生，腎小管排列紊亂；經(jīng)厄貝沙坦和一點紅提取物干預后，與模型組相比，兩組的腎臟病變明顯改善，腎間質(zhì)尚有散在的炎性細胞浸潤，內(nèi)皮細胞尚有些許腫脹，系膜細胞增生已恢復正常，腎小管上皮形態(tài)正常，二者觀察無明顯差異。見圖1、圖2。

3.7 各組大鼠腎組織中TGF-β1和BMP-7免疫組化檢測分析 由圖3和表5顯示，正常對照組大鼠腎組織中TGF-β1有少量表達，而模型組大鼠腎組織中TGF-β1的表達顯著增多(P<0.05)，經(jīng)過厄貝沙坦和一點紅提取物分別干預后，與模型組相比較，厄貝沙坦組和一點紅提取物組大鼠腎組織中TGF-β1的表達顯著減少(P<0.05)，其中厄貝沙坦組大鼠腎組織中TGF-β1的表達略少于一點紅提取物組，但兩者之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠尿液中UPro、UAlb、Ucr及尿液滲透壓比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與厄貝沙坦組比較，△P<0.05

表3 各組大鼠血液中BUN、Scr、UA、Alb、TG、SBP比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與厄貝沙坦組比較，△P<0.05

表4 各組大鼠體重、腎重、腎臟肥大指數(shù)比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

圖1 各組大鼠腎臟的病理變化(HE，400×)

圖2 各組大鼠腎臟的病理變化(PAS染色，400×)

圖3 各組大鼠腎組織中TGF-β1表達(400×)

由圖4和表5顯示，正常對照組大鼠腎組織中BMP-7大量表達，而模型組大鼠腎組織中BMP-7的表達顯著減少(P<0.05)，經(jīng)過厄貝沙坦和一點紅提取物分別干預后，與模型組相比較，厄貝沙坦組和一點紅提取物組大鼠腎組織中BMP-7的表達顯著增多(P<0.05)，兩者BMP-7的表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖4 各組大鼠腎組織中BMP-7表達(400×)

表5 各組大鼠腎組織中TGF-β1、BMP-7表達

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

糖尿病腎病為糖尿病所特有的并發(fā)癥，其病理改變主要為腎小球硬化、腎小球基底膜增厚以及系膜基質(zhì)的過度累積[9-11]。隨著糖尿病病程的進展，腎臟的病變程度逐漸加重，大量累積的系膜基質(zhì)以及增厚的基底膜會擠壓、閉塞毛細血管，從而導致腎臟纖維化，乃至最終腎衰竭的發(fā)生，因此，對于如何延緩糖尿病腎病的進程以及探索有效的防治手段具有十分重大的意義。

有研究報道，TGF-β1是腎臟纖維化發(fā)生的核心因子，能夠促進腎臟細胞肥大、胞外基質(zhì)的積聚，從而導致腎臟纖維化[12]。BMP-7是TGF-β超家族的蛋白之一，可拮抗TGF-β1的作用，并能夠抑制細胞外基質(zhì)的形成和腎小管上皮細胞的分化，從而起到抗腎臟纖維化的作用[13]。由此可見，TGF-β1和BMP-7在腎臟纖維化的過程中有互逆的作用。正常情況下，抑制纖維化作用和促纖維化作用會形成一種動態(tài)平衡，而當出現(xiàn)病理改變時，這種平衡便會被打破，從而導致腎臟纖維化的發(fā)生。

厄貝沙坦是一種強效的血管緊張素Ⅱ受體抑制劑，研究表明，其能夠減少糖尿病腎病的尿蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，保護腎功能，對于延緩糖尿病腎病的發(fā)展進程安全有效[14-17]，故本實驗選擇其作為陽性對照藥物，研究一點紅對糖尿病大鼠的一般狀況、尿液和血液的生化指標、腎臟病理變化以及腎組織中TGF-β1和BMP-7的表達，以探討一點紅對糖尿病的腎保護以及延緩腎病進程的可能機制。

通過研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的24 h飲食量、飲水量、尿量、UPro、UAlb、Ucr、UOP、BUN、Scr、UA、TG、腎重、KI及TGF-β1和BMP-7的表達與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義，病理明顯改變，表明糖尿病大鼠的腎功能已經(jīng)嚴重減退。與模型組相比較，厄貝沙坦組與一點紅提取物組大鼠的24 h飲食量、飲水量、尿量均顯著降低，表明糖尿病的“三多”癥狀明顯改善；尿液中的UPro、UAlb、Ucr等指標和血液中的SUN、Scr、UA、TG等指標降低，以及尿液滲透壓UOP升高，均表明一點紅對糖尿病大鼠的腎臟具有明顯的保護作用；腎重、KI的顯著降低也表明了一點紅能夠顯著減輕糖尿病大鼠的腎臟肥大；同時，免疫組化后TGF-β1表達的顯著降低和BMP-7表達的顯著升高，表明一點紅能夠下調(diào)糖尿病腎組織中TGF-β1的表達水平，提高BMP-7的表達水平；且通過腎臟病理形態(tài)學的觀察，更直接客觀地反映了一點紅對糖尿病大鼠腎臟的改善作用。

此結(jié)果提示，一點紅對糖尿病大鼠的腎臟具有一定的保護作用，其機制可能為降低腎臟中TGF-β1的表達，同時增加BMP-7的表達，使糖尿病腎組織中TGF-β1和BMP-7的表達達到平衡狀態(tài)，從而起到對腎臟的保護作用。其具體機制還有待進一步研究，以便為降糖新藥的開發(fā)及后續(xù)臨床合理用藥奠定基礎。