枸杞多糖對(duì)帕金森病小鼠的抗氧化作用和神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)☆

陳浩 張皓潔 師亮 李瀅昊 任衍康 景瑋 王燕宏 李新毅

帕金森病（Parkinson disease，PD）是中老年人多發(fā)的常見神經(jīng)退行性疾病，以中腦黑質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元變性丟失為主要特征，發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床治療以左旋多巴替代療法為主，雖能改善患者癥狀，但并不能阻止疾病進(jìn)展，長期應(yīng)用還有諸多不良反應(yīng)[1]，探尋新的治療途徑十分必要。眾多研究顯示氧化應(yīng)激是DA能神經(jīng)元選擇性死亡的重要原因[2-3]。一些天然抗氧化劑如姜黃素、茶多酚被證明對(duì)PD有保護(hù)作用[4-5]。研究表明傳統(tǒng)中藥材枸杞具有抗氧化、延緩衰老等顯著功效[6-7]，也常被用于治療PD中藥復(fù)方[8]，但單純枸杞或枸杞提取物對(duì)PD的影響鮮見被報(bào)道。現(xiàn)代藥理研究顯示枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharide，LBP）是枸杞的主要功效成分，能自由通過并調(diào)節(jié)血腦屏障[9]。本研究旨在觀察LBP對(duì)帕金森病小鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的影響，并探討其作用機(jī)制，以期為PD藥物治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）購于 Sigma 公司，左旋多巴（L-DOPA）購于上海福達(dá)制藥公司 （藥準(zhǔn)字H31022793），LBP購于上?？抵壅婢嗵枪荆每剐∈骉H多克隆抗體購于Abcam公司，SP超敏試劑盒購于福州邁新生物公司，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）試劑盒均購于南京建成生物公司。其余試劑為國產(chǎn)市售分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理健康雄性C57BL/6N小鼠 （山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK2002-0003）75 只，體重 18～22 g，8～12 周齡，隨機(jī)分為5組，每組15只。①M(fèi)PTP組：參照文獻(xiàn)腹腔注射 MPTP（40 mg/kg），每日 1次，連續(xù) 7 d，制備PD小鼠動(dòng)物模型[10]。②L-DOPA組：每天注射MPTP前3 h先灌胃給予一次L-DOPA（40 mg/kg），然后再進(jìn)行MPTP注射，連續(xù)7 d。③LBP組：MPTP注射前3 d灌胃給予不同濃度LBP，每日1次，連續(xù)3 d；隨后在每天注射MPTP前3 h先灌胃給予一次LBP，再進(jìn)行MPTP注射，連續(xù)7 d。本研究選用兩個(gè)LBP濃度處理動(dòng)物：中劑量50 mg/kg和高劑量100 mg/kg，即LBP組分為兩個(gè)濃度亞組。④Control組：腹腔注射等體積生理鹽水。每次注射后2 h觀察小鼠的行為表現(xiàn)，并于最后一次注射后進(jìn)行爬桿實(shí)驗(yàn)。

1.3 爬桿實(shí)驗(yàn)采用宣武醫(yī)院的方法[10]，在一根長50 cm、粗1 cm的垂直木桿頂端固定一軟木塞，將小鼠輕置于木塞上，1 min后將木塞倒放，小鼠開始向上爬行，在3 s內(nèi)爬行至木桿的一半者記3分，6 s者記2分，超過6 s者記1分。每只動(dòng)物重復(fù)3次。

1.4 免疫組化染色爬桿實(shí)驗(yàn)完畢后，立即斷頭取腦，在冰面上小心分離中腦，一部分標(biāo)本用于氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測；另一部分標(biāo)本迅速投入4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，制作20 μm厚連續(xù)切片，切片經(jīng)脫蠟水化和抗原修復(fù)后滴加兔抗小鼠TH多克隆抗體（1∶200），4℃過夜，PBS 沖洗，再依次滴加SP超敏試劑，室溫2 h，DAB顯色，脫水透明封片。鏡下觀察選取黑質(zhì)范圍內(nèi)的切片，在同一背景光強(qiáng)度下進(jìn)行顯微攝影，依照?qǐng)D譜劃定每張切片黑質(zhì)的范圍，采用IPP6.0圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)TH陽性細(xì)胞數(shù)量。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測用勻漿器將采集到的中腦標(biāo)本制成10%的組織勻漿，-80℃凍存。按照試劑盒使用說明，在Bradford法定量蛋白后，采用化學(xué)比色法檢測組織標(biāo)本中的 SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，采用單因素方差分析，方差齊采用LSD檢驗(yàn)；方差不齊采用Dunnett's t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 行為學(xué)評(píng)價(jià)MPTP組小鼠于第1次MPTP注射后2 h出現(xiàn)豎毛、間斷震顫等表現(xiàn)；第4次MPTP注射后出現(xiàn)顫尾、頻繁震顫和活動(dòng)減少；最后1次MPTP注射后出現(xiàn)連續(xù)震顫、頻繁吞咽、四肢僵硬和活動(dòng)受限。經(jīng)L-DOPA和LBP處理后，小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)較MPTP組小鼠減輕，癥狀持續(xù)時(shí)間也縮短，尤以L-DOPA最為明顯。Control組小鼠活動(dòng)自如，未見上述癥狀。爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與 MPTP 組（3.53±1.32）相比，Control組（7.61±1.53）、L-DOPA 組 （6.87±1.51）、50 mg/kg LBP 組（5.07±1.28）和 100 mg/kg LBP 組（5.20±1.37）四組小鼠得分均遠(yuǎn)高于MPTP組小鼠（P＜0.01）（圖1），即爬完桿子全程所用時(shí)間較少，說明上述4組的肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)情況較好。兩個(gè)LBP處理組爬桿得分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但都小于Control組和LDOPA 組（P＜0.05）（圖 1），說明 L-DOPA 對(duì) PD 行為癥狀改善優(yōu)于LBP。

圖1 爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （n=15）。 1)與 MPTP組比較，P＜0.01；2)與Control組比較，P＜0.05； 3)與 L-DOPA 組比較，P＜0.05

2.2 黑質(zhì)TH免疫組化染色結(jié)果Control組小鼠黑質(zhì)可見大量TH陽性神經(jīng)元，細(xì)胞密集分布，排列成數(shù)層，呈粗條帶狀（圖2）；MPTP組小鼠黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量較對(duì)照組明顯減少（340±31 vs.1204±112，P＜0.01），細(xì)胞稀疏分布，呈染色較淺的細(xì)條帶 （圖2）；L-DOPA組小鼠TH陽性細(xì)胞數(shù)量也較 Control組減少明顯（295±63 vs.1204±112，P＜0.01），呈較 MPTP 組略短的淺細(xì)條帶分布（圖2），但統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示兩組細(xì)胞數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 在50 mg/kg LBP 組（655±78）與100 mg/kg LBP 組（704±38），TH 陽性神經(jīng)元數(shù)量均較MPTP組或 L-DOPA組明顯增多 （P＜0.01），呈染色較深的細(xì)條帶分布，但仍少于對(duì)照組 （P＜0.01）（圖2）；兩個(gè)LBP組TH陽性細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組小鼠中腦氧化應(yīng)激情況MPTP組小鼠中腦組織 SOD、GSH-Px和 CAT酶活力顯著低于Control組，MDA含量則顯著高于Control組（表1）（P＜0.01）；經(jīng) L-DOPA處理后，小鼠中腦SOD、GSH-Px和CAT酶活力反而較MPTP組進(jìn)一步降低，MDA 含量則進(jìn)一步升高（表 1）（P＜0.05）；經(jīng)兩種濃度LBP處理后，小鼠SOD、GSH-Px和CAT酶活力均較MPTP組或L-DOPA組有顯著升高，MDA含量則均較MPTP組或L-DOPA組有顯著下降（表 1）（P＜0.01）；100 mg/kg LBP 組小鼠 SOD、GSH-Px和CAT酶活力稍高于50mg/kg LBP組，MDA 含量則較其稍低（表 1）（P＜0.05）。

圖2 黑質(zhì)致密部TH免疫組化染色結(jié)果（n=9,±s）。1)與Contro組比較，P＜0.01； 2)與 lMPTP 組比較，P＜0.01；3)與 L-DOPA 組比較，P＜0.01

3 討論

枸杞是一味藥食兩用的中藥材，在我國已有兩千多年的使用歷史。LBP是枸杞的主要活性成分，近年來研究發(fā)現(xiàn)LBP除具有獨(dú)特滋補(bǔ)作用外，還有神經(jīng)保護(hù)作用[11]。用LBP處理大腦缺血-再灌注損傷模型，可顯著降低神經(jīng)功能缺損程度，減小模型動(dòng)物腦梗死的面積[12]。LBP對(duì)視神經(jīng)切斷術(shù)后軸索變性也有緩解作用，能明顯延緩中樞神經(jīng)系統(tǒng)的繼發(fā)變性[13]。針對(duì)阿爾茲海默病、老年癡呆癥等神經(jīng)退行性疾病研究發(fā)現(xiàn)，LBP一方面可減少淀粉樣蛋白產(chǎn)生和抑制淀粉樣肽蛋白酶活性，降低其誘導(dǎo)的蛋白激酶激活，減少神經(jīng)細(xì)胞死亡；另一方面還可促進(jìn)海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生，改善其學(xué)習(xí)記憶能力[14]。PD是發(fā)病率僅次于阿爾茲海默病的全球第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，兩種疾病有許多共性的病理機(jī)制[15]，且枸杞在中醫(yī)治療PD的方劑中也經(jīng)常被使用，提示枸杞可能對(duì)PD有潛在的治療價(jià)值。 有體外研究表明枸杞提取物可提高M(jìn)PP+處理的線蟲模型和PC12細(xì)胞存活率，對(duì)抗MPP+的神經(jīng)毒性[16]。但目前未見有枸杞或枸杞提取物用于PD體內(nèi)研究的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究制作MPTP帕金森病小鼠模型，首先觀察了枸杞主要組分——LBP對(duì)PD小鼠行為學(xué)和病理學(xué)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型小鼠出現(xiàn)震顫麻痹等典型PD臨床表現(xiàn)，肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)情況也較差，同時(shí)伴有黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元的大量丟失，說明本研究復(fù)制的動(dòng)物模型符合實(shí)驗(yàn)要求。經(jīng)過L-DOPA處理后，PD小鼠的行為表現(xiàn)明顯改觀，肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)情況顯著改善，但仍伴有黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的大量減少，提示L-DOPA替代治療雖然能改善患者的癥狀，但并不能阻止疾病的進(jìn)程，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[1]。鑒于低濃度LBP對(duì)小鼠的保護(hù)作用較弱[9]，本研究直接選用中、高濃度LBP作用于模型小鼠。經(jīng)過LBP處理后，小鼠的行為表現(xiàn)和肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)情況改善效果雖不如L-DOPA組顯著，但黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的丟失情況卻有所緩解，提示LBP不但能改善PD小鼠行為癥狀，而且對(duì)中腦DA能神經(jīng)元具有一定神經(jīng)保護(hù)作用。此外，兩個(gè)LBP濃度組小鼠間的行為表現(xiàn)和黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目并無顯著差異，提示中等濃度枸杞多糖即可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)相應(yīng)。

表1 各組小鼠中腦氧化應(yīng)激情況（±s）

表1 各組小鼠中腦氧化應(yīng)激情況（±s）

1)與 Control組比較，P＜0.01；2)與 MPTP 組比較，P＜0.05；3)與 L-DOPA 組比較，P＜0.01；4)與 50 mg/kg LBP 組比較，P＜0.05

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雖然PD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但大量研究表明線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、自噬障礙、鈣超載、鐵代謝異常等多種機(jī)制均參與黑質(zhì)DA能神經(jīng)元丟失過程，而氧化應(yīng)激是上述機(jī)制中共同存在的病理過程，被認(rèn)為是PD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)和核心因素[2-3,15]。多項(xiàng)臨床研究已證實(shí)：PD患者腦內(nèi)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[2]。神經(jīng)遞質(zhì)DA能夠自發(fā)氧化產(chǎn)生ROS自由基、苯醌等細(xì)胞毒性物質(zhì)，在正常情況下被體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)清除；而在氧化應(yīng)激時(shí)，蛋白水解酶活性降低，自由基清除能力減弱，過多的自由基不單會(huì)加速DA自氧化，還會(huì)造成細(xì)胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或DNA等損傷，影響線粒體功能，導(dǎo)致更多自由基產(chǎn)生，進(jìn)一步增強(qiáng)氧化反應(yīng)。在機(jī)體防御體系中，SOD是清除自由基的第一道防線，可歧化O2-為O2和H2O2；H2O2則繼續(xù)被CAT分解為 O2和 H2O；GSH-Px可特異催化 GSH對(duì)H2O2的還原，可直接反映機(jī)體清除自由基的能力；MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)后的產(chǎn)物，可間接反映機(jī)體抗氧化酶的功能[17]。本研究中，MPTP組小鼠在DA能神經(jīng)元丟失的同時(shí)，伴有中腦組織SOD、GSH-Px和CAT活性較對(duì)照組顯著降低和MDA含量顯著升高，提示模型動(dòng)物中腦抗氧化系統(tǒng)功能減弱，自由基增多，細(xì)胞正處于脂質(zhì)過氧化階段。經(jīng)L-DOPA處理后，小鼠中腦組織SOD、GSH-Px和CAT含量較MPTP組還低；MDA含量則較其升高，提示L-DOPA組動(dòng)物腦內(nèi)處于比MPTP組還嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)。這可能是因?yàn)長-DOPA在腦內(nèi)代謝也產(chǎn)生ROS自由基，加重了脂質(zhì)氧化和細(xì)胞損傷[18]。枸杞是具有優(yōu)良抗自由基和抗氧化功效的傳統(tǒng)中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》記載其“名目安神，令人長壽”。針對(duì)衰老的研究發(fā)現(xiàn)，LBP可提高機(jī)體氧化酶的活力，增強(qiáng)清除自由基的能力，減緩脂質(zhì)過氧化，延緩衰老[7]。本研究用LBP處理模型動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)其不但可以減少DA能神經(jīng)元丟失，還可增強(qiáng)中腦SOD、GSH-Px和CAT活性和減少M(fèi)DA含量。提示LBP對(duì)PD模型中腦的氧化應(yīng)激也具有緩解作用，且中等劑量LBP對(duì)氧化狀態(tài)的改善已十分明顯；而打破氧化應(yīng)激惡性循環(huán)是保護(hù)DA能神經(jīng)元，避免其損傷丟失的必要途徑[19]。

綜上所述，L-DOPA作為PD治療的一線用藥，能夠改善其行為癥狀，但同時(shí)會(huì)加重中腦氧化應(yīng)激，造成DA能神經(jīng)元進(jìn)一步損傷；LBP通過清除自由基和抗氧化作用，能減少DA能神經(jīng)元的損傷，對(duì)MPTP帕金森病小鼠起到神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，且中等劑量LBP效果就已十分顯著。將L-DOPA和中等劑量LBP聯(lián)合應(yīng)用，可能一方面能夠提高PD的臨床療效，另一方面改善L-DOPA治療的不足。對(duì)此尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。