復(fù)合SDF-1的PLGA材料促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和遷移初探

姜楊 李永濤 徐桂清 郭林娜 張彧婷 沈雷 姚立杰 王玉

（1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室 黑龍江 齊齊哈爾 161006）

（2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 黑龍江 齊齊哈爾 161006）

（3齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室 黑龍江 齊齊哈爾 161006）

引言

目前，組織工程技術(shù)的快速發(fā)展，早已成為許多學(xué)者研究的熱點(diǎn)，但組織工程學(xué)修復(fù)損傷肌腱的研究還是很少。肌腱損傷治療還停留在傳統(tǒng)的治療手段上，如縫合、移植等，治療后也會(huì)出現(xiàn)肌腱重復(fù)斷裂，對(duì)患者造成精神和身體上一定痛苦。隨著組織工程技術(shù)的開展，有些學(xué)者提出組織工程手段修復(fù)損傷肌腱，為治療肌腱損傷提供一個(gè)新的治療方法。姜任武等[1]將MSCs培養(yǎng)在支架上，放于跟腱損傷部位，8周后復(fù)合物與肌腱融合，無瘢痕形成。本實(shí)驗(yàn)研究選取的種子細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，支架材料為PLGA高分子材料。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是目前組織工程最理想的種子細(xì)胞，獲得容易，來源于骨髓，屬于來源發(fā)育早期中胚層一類成體干細(xì)胞，優(yōu)點(diǎn)具有多向分化性特性和自我更新能力，其取材方便，能在體外貼壁、增殖生長(zhǎng)的細(xì)胞。很多學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)研究得出間充質(zhì)干細(xì)胞在一定誘導(dǎo)條件下可以分化成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞，促進(jìn)損失組織愈合作用[2]。目前研究乳酸-乙醇酸（PLGA）是目前理想的生物組織支架材料，其特點(diǎn)具有生物相容性、降解性好以及較好的力學(xué)性能，應(yīng)用在納米醫(yī)學(xué)范疇內(nèi)[3]。在高分子生物支架上加入緩釋一定濃度趨化因子SDF-1，趨化因子是細(xì)胞因子家族中小分子蛋白質(zhì)，具有趨化作用的[4]。SDF-1（又稱CXCL12），屬于趨化家族中的一員，有學(xué)者研究：與配體CXCR4結(jié)合成生物軸，形成CXCL12∕CXCR4軸，其軸是調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向損傷部位遷移發(fā)揮重要作用[5]。CXCL12∕CXCR4軸同時(shí)增加間充質(zhì)干細(xì)胞生存活性及增殖等作用[6]。本實(shí)驗(yàn)通過組織工程手段研究趨化因子SDF-1復(fù)合PLGA支架材料，觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植在復(fù)合支架上的增殖和趨化能力。

1.材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清（美國(guó)Gibco），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone），青鏈霉素（美國(guó)Gibco），胰蛋白酶（Sigma 公司），4%多聚甲醛，大鼠SDF-1（美國(guó)Abcam），PLGA（上海聚睿生物公司）。

超凈工作臺(tái)，二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡（日本Olympus），Transwell小室（美國(guó)Corning），CCK-8試劑盒（碧云天）Emax 酶標(biāo)儀為（美國(guó) Molecular Devices），高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），震蕩儀（躍進(jìn)儀器廠），靜電紡絲機(jī)（SS-2535DC）。

1.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)：取2～4周齡SD大鼠（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供），體重100g左右，斷頸處死，分離股骨，無菌環(huán)境下處理取大鼠股骨兩端剪開，3mlPBS培養(yǎng)基沖洗骨髓腔1～2次，離心管收集細(xì)胞懸液1000r/s，離心5～10min，用槍頭吸出上清液，加入培養(yǎng)液，用培養(yǎng)液吹均勻離心管下層組織，放入25cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，12～24h觀察換液，觀察細(xì)胞培養(yǎng)瓶有霧狀細(xì)胞聚集，慢慢去除未貼壁細(xì)胞，之后每3d進(jìn)行換液。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、狀態(tài)，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底80%～90%進(jìn)行消化和傳代，第三代間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 聚乳酸-乙醇酸納米高分子材料制備

將PLGA材料溶于六氟異丙醇和冰醋酸溶液中，制備3%比重聚合物溶液，在室溫下放在攪拌器上，用磁力棒攪拌，混勻，一般24小時(shí)左右。打開靜電紡絲機(jī)電源預(yù)熱，推注器選用2.5ml注射器，噴絲直徑0.5mm，速度0.6mL∕h，電極距離12cm，鋁箔接收后放入干燥箱內(nèi)，-80℃保存。

1.4 緩釋SDF-1的納米材料制備

殼聚糖緩釋SDF-1到聚乳酸-乙醇酸納米高分子材料，并進(jìn)行紫外照射滅菌。

1.5 將BMSCs加入緩釋SDF-1的納米材料

將4×105個(gè)BMSCs滴加到緩釋SDF-1聚乳酸-乙醇酸納米高分子材料上，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 培養(yǎng)各組細(xì)胞（BMSCs對(duì)照組、BMSCs+PLGA組、緩釋SDF-1復(fù)合PLGA生物纖維肌腱+BMSCs組）24小時(shí)，提取各組細(xì)胞上清液。

1.7 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組BMSCs細(xì)胞增殖能力

按照CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行操作，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSCs細(xì)胞，取將第三代間充質(zhì)干細(xì)胞用胰蛋白酶消化1～2min，計(jì)數(shù)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組取1×105個(gè)MSC滴加到殼聚糖緩釋SDF-1到聚乳酸-乙醇酸納米高分子材料，對(duì)照組取1×105cells/mL密度直接接種于96孔板，每孔加入培養(yǎng)液200μL，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1天等待貼壁，給予換液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別在第1天、3天、5天棄掉原培養(yǎng)液，加入CCK-8溶液10μl，培養(yǎng)4小時(shí)，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度（OD值），取5孔平均值作為各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞體外遷移的影響

按照Transwell試劑盒說明書進(jìn)行操作，將第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化1～2min，細(xì)胞計(jì)數(shù)器調(diào)整骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞密度1×105個(gè)/mL，取細(xì)胞懸液200μL加入Transwell小室的上室，下室分別為500μLDMEM含120ng/ml濃度SDF-1因子復(fù)合PLGA上清液的培養(yǎng)液和含PLGA上清液的培養(yǎng)液，對(duì)照組為500μL的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h，培養(yǎng)結(jié)束后4%多聚甲醛固定20min，0.1%結(jié)晶紫染色20min，在倒置顯微鏡下觀察，每個(gè)復(fù)孔隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)使用SPSS18.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以（±s）表示，配對(duì)樣本進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 各組CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)比較

BMSCs對(duì)照組、BMSCs+PLGA組、緩釋SDF-1復(fù)合PLGA材料+ BMSCs組，各組間充質(zhì)干細(xì)胞活性的影響。結(jié)果S-BP實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性比BP組細(xì)胞活性增強(qiáng)（P＜0.01），BP組細(xì)胞活性比正常對(duì)照組細(xì)胞活性增強(qiáng)（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表。

表 各實(shí)驗(yàn)組BMSCs吸光度(OD值)的比較（±s，n=3）

表 各實(shí)驗(yàn)組BMSCs吸光度(OD值)的比較（±s，n=3）

與正常對(duì)照組相比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 1d 3d 5d正常對(duì)照組 0.49±0.03 0.62±0.02 0.68±0.01 BP 組 0.59±0.02* 0.71±0.05* 0.78±0.04*S-BP 組 0.68±0.03* 0.83±0.04** 0.89±0.02**

2.2 各組細(xì)胞Transwell遷移實(shí)驗(yàn)比較

S-BP實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組比較有顯著性差別（P＜0.01），BP組與正常對(duì)照組相比較有明顯差別（P＜0.05）；具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖。

圖 各實(shí)驗(yàn)組BMSCs遷移數(shù)量作用的比較（±s，n=3）與正常對(duì)照組相比較*P＜0.05，**P＜0.01。

3.討論

隨著現(xiàn)代體育運(yùn)動(dòng)熱潮的盛行，許多人都加入體育活動(dòng)中。但是，由于鍛煉的方式不恰當(dāng)或者年齡限制等許多因素，導(dǎo)致肌肉、肌腱損傷或斷裂的病例越來越多。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球報(bào)道每年超過3000萬肌腱損傷案例[7]。目前傳統(tǒng)的治療方式主要是理療、縫合以及自體或同種異體移植、人工合成材料等，但治療愈后效果不理想。隨著社會(huì)科技不斷進(jìn)步，醫(yī)學(xué)治療手段飛速發(fā)展，近年來，許多研究者運(yùn)用干細(xì)胞復(fù)合生物支架材料的組織工程手段，加速了損傷肌腱等組織愈合再生[8]。

本研究實(shí)驗(yàn)的種子細(xì)胞是取材方便、成活率高的大鼠成體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，BMSCs免疫原性低，分化能力強(qiáng)，是理想的組織工程種子之一。生物支架是生物相容性、降解性好和力學(xué)性能好的PLGA高分子材料，可以安全應(yīng)用于人體內(nèi)[9]。細(xì)胞因子也是組織工程不可缺少的重要組成部分，本實(shí)驗(yàn)選擇在前期研究的趨化家族因子SDF-1，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞有趨化作用，趨化因子SDF-1與CXCR4結(jié)合，激活下游蛋白，招募間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢到損傷部位，參與修復(fù)組織。本實(shí)驗(yàn)研究利用趨化因子殼聚糖緩釋120ng/ml濃度SDF-1到聚乳酸-乙醇酸納米高分子材料，再加入一定計(jì)數(shù)BMSCs放入支架進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，來觀察BMSCs在復(fù)合SDF-1的PLGA材料支架上相容性和BMSCs增殖及遷移情況。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果得出SDF-1因子和BMSCs可粘附在PLGA支架材料，說明PLGA支架材料無毒性；BMSCs在支架上形態(tài)呈梭形，生長(zhǎng)情況較好，與PLGA支架材料相容性好。CCK-8增殖檢測(cè)S-BP實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性比BP組細(xì)胞活性增強(qiáng)（P＜0.01），BP組細(xì)胞活性比正常對(duì)照組細(xì)胞活性增強(qiáng)（P＜0.05）；Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞遷移率S-BP實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組比較有顯著性差別（P＜0.01），BP組與正常對(duì)照組相比較有明顯差別（P＜0.05）；復(fù)合SDF-1的PLGA支架材料可有效的使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和遷移。進(jìn)而我們可以推測(cè)出SDF-1趨化因子復(fù)合PLGA支架能夠使BMSCs增殖并且趨化使BMSCs至損傷肌腱位置，也參與損傷肌腱修復(fù)，也為下一步實(shí)驗(yàn)的開展提供了實(shí)驗(yàn)鋪墊。

綜上所述，利用組織工程技術(shù)促進(jìn)肌腱組織修復(fù)已經(jīng)成為日益重視的研究領(lǐng)域，復(fù)合型生物肌腱材料促進(jìn)損傷肌腱的修復(fù)、再生及血管化是目前很多學(xué)者即要解決的問題，本研究通過構(gòu)建復(fù)合SDF-1的PLGA材料支架有效趨化BMSCs遷移，但SDF-1趨化因子復(fù)合PLGA支架材料招募BMSCs歸巢的機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。