七葉一枝花地上部分總黃酮的測(cè)定研究

張玉霖 余海峰 周亮 張又枝（通訊作者） 陳錦紅

（湖北科技學(xué)院藥學(xué)院 湖北 咸寧 437100）

七葉一枝花(Paris polyphylla)為重樓屬多年生草本植被，屬十分珍貴的藥材，有悠久的藥用歷史，具有抗菌抑菌、止血消炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用[1]。包括七葉一枝花在內(nèi)的重樓屬植物，其藥用成分主要為皂苷、黃酮類等物質(zhì)[2]。黃酮類化合物具有抗病毒、抗氧化、預(yù)防心腦血管疾病、抗腫瘤、清除自由基等多方面的功用[3]。由于目前七葉一枝花常用根部入藥，而其地上的莖、葉部分常被丟棄，為更充分利用七葉一枝花的現(xiàn)有資源，測(cè)定其莖、葉不同部位總黃酮，給合理利用整株七葉一枝花提供理論依據(jù)。本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-6]，選用蘆丁為對(duì)照，利用蘆丁和鋁的絡(luò)合物產(chǎn)生熒光的原理來測(cè)定七葉一枝花中總黃酮的含量，結(jié)果滿意。

1.材料與儀器

1.1 材料

七葉一枝花地上莖、葉，采購(gòu)于長(zhǎng)陽(yáng)澤昊中藥材種植基地。蘆丁對(duì)照品（批號(hào)161223，購(gòu)自上海圻明生物科技有限公司），硝酸鋁、乙酸鈉、甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸等均為分析純。

1.2 儀器

RF-5301型熒光分光光度計(jì)(日本島津)；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；萬(wàn)分之一電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；DHG-9140B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司）；FW177型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；LDZ4-0.8低速自動(dòng)離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）、PHS-3C型PH計(jì)（上海雷磁精密科學(xué)儀器有限公司）；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州市亞榮儀器有限公司）。

2.方法與結(jié)果

2.1 七葉一枝花總黃酮的提取方法

將七葉一枝花地上莖、葉分開，除雜洗凈，烘干粉碎。按照文獻(xiàn)[7]方法，精密稱取莖、葉樣品粉末各一定量加石油醚脫脂脫色后揮干，按液料比15：1加入90%乙醇超聲提取30min，重復(fù)提取2次，合并提取液，以90%乙醇定容至50mL。

2.2 測(cè)定條件的選擇

精密稱取蘆丁對(duì)照品，用90%乙醇配成0.5g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，移取該溶液液0.8mL至25mL容量瓶，加入10% Al（NO3）3溶液1.6mL、不同PH（2.7、3.6、4.5、5.4）的HAC-NaAC緩沖溶液0.8mL，用不同體積分?jǐn)?shù)（50%，70%，90%，100%）乙醇定容，搖勻?？疾煲掖俭w積分?jǐn)?shù)、溶液PH對(duì)熒光測(cè)定的影響。在激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度均為5nm條件下掃描，測(cè)得激發(fā)波長(zhǎng)=430nm，發(fā)射波長(zhǎng)=483nm。

不同體積分?jǐn)?shù)（50%，70%，90%，100%）乙醇的影響結(jié)果見圖1。圖1表明，配合物的熒光強(qiáng)度基本隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增強(qiáng)，且乙醇體積分?jǐn)?shù)變大后，最大峰位略微向右移動(dòng)。當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí)，熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于其它濃度。所以，本實(shí)驗(yàn)選定90%乙醇為測(cè)定溶劑。

圖1 不同濃度乙醇溶劑的影響

不同PH緩沖溶液的影響見圖2，隨著溶液PH值的升高，熒光強(qiáng)度值先增高后減弱?？梢姴煌琍H的溶液會(huì)影響配合物的穩(wěn)定性。當(dāng)加入PH=3.6的緩沖溶液時(shí)，熒光強(qiáng)度最大，本實(shí)驗(yàn)選擇加入PH=3.6的HAC-NaAC緩沖溶液。

圖2 不同PH的影響

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取0.5g·L-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.5mL于6只25ml容量瓶中，依次加入10%Al（NO3）3溶液1.6mL及PH=3.6HAC-NaAC緩沖溶液0.8mL，最后用90%乙醇定容，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以試劑空白為參比，測(cè)定各蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，蘆丁濃度在0.004～0.03g·L-1的范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=33573X-13.715，Y表示熒光強(qiáng)度，X表示蘆丁濃度，相關(guān)系數(shù)r2為0.9991。

2.4 精密度試驗(yàn)

取同一份樣品溶液平行測(cè)定6次，測(cè)得溶液中總黃酮濃度分別為 18.742、18.695、18.377、18.421、18.869、18.471ug·L-1，RSD為0.19%，表明方法精密度良好。

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

為了驗(yàn)證本法測(cè)定的準(zhǔn)確性，在樣品溶液中加入蘆丁對(duì)照品進(jìn)行考察。準(zhǔn)確稱取樣品6份，再加入不同量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品測(cè)定方法提取、測(cè)定，結(jié)果見表。該方法平均回收率為96.55%，說明該方法準(zhǔn)確可行。

表 七葉一枝花總黃酮回收率試驗(yàn)

2.6 樣品測(cè)定

精密量取“2.1”項(xiàng)下莖、葉提取液各一定量，分別加入10%Al（NO3）3溶液1.6mL及PH=3.6HAC-NaAC緩沖溶液0.8mL，用90%乙醇定容至25mL，測(cè)定各溶液熒光強(qiáng)度，代入回歸方程，求得莖、葉中總黃酮含量分別為4.86、6.12mg·g-1。

3.討論

本文采用熒光分光光度法測(cè)定七葉一枝花總黃酮含量，考察了乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù)、溶液PH等對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)表明，在本文實(shí)驗(yàn)條件下，蘆丁濃度在0.004～0.03g·L-1范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系，平均回收率為96.55%。熒光法對(duì)比傳統(tǒng)的紫外分光光度法靈敏度更高，且操作簡(jiǎn)單，可以作為測(cè)定七葉一枝花總黃酮含量的方法。樣品測(cè)定結(jié)果表明，七葉一枝花地上的莖、葉中含有豐富的黃酮類化合物，可以充分利用。