基于鞘脂組學技術探究布洛芬對斑馬魚腦組織的立體選擇性影響

宋 月， 張茜寧， 張 崴， 錢永忠， 邱 靜*

(1．中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所，北京100081;2．農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質量安全重點實驗室，北京100081;3．山東萊博生物科技有限公司，山東濟南250000)

布洛芬(IBU)是一種非處方藥，常作為典型的退燒藥和止痛藥用于疾病治療，同時也是一種廣泛存在于水環(huán)境中的新型環(huán)境污染物——藥品及個人護理用品(PPCPs)［1］。研究表明，IBU可以引起氧化損傷、免疫功能紊亂和神經(jīng)損傷等毒性作用［2－4］。IBU屬于手性藥物，而且R-(－)-IBU和S-(+)-IBU在環(huán)境中都有檢出且在性質和毒性方面存在差異［5］。IBU在人體和動物體內(nèi)并不能完全代謝，有一部分會通過尿液和糞便排放到水體和土壤中。由于IBU具有脂溶性的特點，環(huán)境中的IBU會通過食物鏈和食物網(wǎng)在動植物體內(nèi)累積并傳遞至人體，從而影響人體正常代謝，威脅人類健康。

隨著IBU在全世界范圍內(nèi)的大量使用，其在河流、湖泊、海洋、土壤以及動植物體內(nèi)的檢出率越來越高［6－7］。據(jù)報道，西班牙的圖里亞河地表水和污泥中檢出IBU質量濃度為0.18～7.20 μg/L，海水中檢出IBU質量濃度為3.90 μg/L，而在美國和挪威海水中檢出質量濃度分別在N．D．～674.00 ng/L和 0.10～ 20.00 μg/L 范圍內(nèi)［8－11］，文獻［12］甚至在飲用水中也檢出了IBU殘留。目前IBU已經(jīng)廣泛存在于世界范圍內(nèi)的水環(huán)境中，但對于其外消旋體(rac-IBU)及單體的毒性還尚未明確［13］。目前對于IBU對映體的選擇性毒性研究較少，所以明確環(huán)境濃度水平的IBU對映體對水生生物的毒性作用顯得尤為重要。

斑馬魚作為實驗室常用模式生物，在評估環(huán)境污染物對水生生物的影響時應用較多。有研究報道，IBU不僅可導致斑馬魚出現(xiàn)胚胎發(fā)育遲緩、卵孵化率降低、仔魚體長發(fā)生變化［14］，而且會引起斑馬魚自發(fā)運動頻率和游動距離減少，游動速度降低［15，16］。此 外，IBU 暴 露 還 可 導 致 斑 馬 魚 中cytochrome P4501A、vitellogenin(vtg)基因表達及抗氧化酶活發(fā)生變化［17，18］。

脂質組學技術是針對生物體或細胞中含量較多、成分較為復雜的脂質而發(fā)展起來的現(xiàn)代組學技術。從一定意義上來說，脂質組學技術可視為代謝組學技術的一個分支。Kovacevic等［19］借助于核磁技術開展了IBU外消旋體對大型溞的毒性研究。結果表明，IBU外消旋體暴露會導致大型溞體內(nèi)絲氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、精氨酸和亮氨酸發(fā)生顯著變化，且具有明顯的劑量依賴性。Akhtar等［20］借助于核磁技術開展了大麻素對斑馬魚的毒性研究。結果表明，大麻素暴露會導致斑馬魚胚胎體內(nèi)部分氨基酸發(fā)生變化，主要包括谷氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、?；撬?、苯丙氨酸、膽堿、肌酸和甘氨酸等。由于脂質組學起步較晚，所以在毒理學研究中的應用不如代謝組學應用廣泛［21］。但脂質分子結構的復雜性和多樣性，賦予了脂質分子許多重要的生理功能。鞘脂是一類廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的脂質，對于調節(jié)細胞膜的流動性具有重要作用。此外，神經(jīng)酰胺、鞘氨醇、1-磷酸-神經(jīng)鞘氨醇等作為信號分子在細胞生長、分化、衰老和死亡中起到重要作用［22］。因此，借助于鞘脂組學技術進行毒理學研究具有十分重要的現(xiàn)實意義。

為了探究環(huán)境中IBU外消旋體及對映體對水生生物的選擇性影響，本研究基于靶向鞘脂組學技術，以斑馬魚為模式生物，開展了環(huán)境濃度的布洛芬暴露試驗。通過脂質組學數(shù)據(jù)分析，探究布洛芬手性對映體的毒性差異，以期明確環(huán)境中布洛芬對水生生物的毒性作用機制，為進一步研究PPCPs提供新思路。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四極桿-線性離子阱復合質譜(ExionLC UHPLC-Qtrap 6500，AB Sciex公司)，高速冷凍離心機(美國ThermoFisher公司)，多功能氮吹儀(TTL-DC型，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司)，渦旋混勻器(IKAVortex Genius 3，德國IKA集團)。

rac-IBU(純度98.0%，中國天津阿爾塔公司)，R-(－)-IBU和S-(+)-IBU由本實驗室拆分制備得到［23］，46種神經(jīng)鞘脂標準品(純度＞99.0%，美國Avanti Polar Lipids公司)。乙腈和甲醇(質譜級，德國Merck公司)，正己烷和異丙醇(色譜級，加拿大Fisher公司)，氯仿(韓國Duksan公司)，甲酸和甲酸銨(質譜級，美國Sigma-Aldrich公司)，超純水采用美國Milli-Q超純水制備系統(tǒng)制備。

1．2 實驗方法

1．2．1 標準溶液的配制

準確稱取46種神經(jīng)鞘脂標準品分別溶解于適量體積的甲醇中(個別鞘脂在甲醇中溶解較小，加入微量氯仿促進溶解)，配制成500 mg/L或1 000 mg/L的標準母液，置于－20℃冰箱中保存。

1．2．2 46 種鞘脂的色譜分離條件

Agilent Eclipse XDB C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm);柱溫為30℃;樣品室溫度為4℃;流動相A 為0.1%甲酸甲醇-水(40∶60，v/v)，流動相B為0.1%甲酸甲醇-異丙醇(40∶60，v/v)，洗脫梯度如下:0～3.0 min，0～80%B;3.0～8.0 min，80%B～90%B;8.0～15.0 min，90%B～95%B;15.1～17.0 min，0%B。流速為0.4 mL/min;進樣量為 1 μL。

1．2．3 質譜條件

采集模式為正離子模式下的Schedule MRM模式，離子源電壓為5 000 V，離子源溫度為600℃，霧化氣和輔助氣均為379 kPa，每種鞘脂的離子對信息及去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)見表1。

表1 46種鞘脂的保留時間、母離子(Q1)、子離子(Q3)、去簇電壓和碰撞能Table 1 Retention times，precursor ions(Q1)，product ions(Q3)，declustering potentials(DP)and collision energies(CE)of the 46 sphingolipids

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

1．2．4 暴露試驗

進行暴露試驗之前，需將待暴露的斑馬魚提前飼養(yǎng)至少一周，以保證魚適應當前飼養(yǎng)環(huán)境。按照4 L水最多10條魚的比例，將待暴露的1 200條成年斑馬魚平均隨機分裝到12個魚缸中，每缸100條斑馬魚，設置4組，分別為溶劑對照組、rac-IBU暴露組、左旋體暴露組和右旋體暴露組，每組設置3個平行，布洛芬的暴露濃度設置為5 μg/L，暴露周期為28天。對照組采用丙酮溶液作對照，丙酮的體積與加入的布洛芬體積保持一致，為200 μL，不超過全部水溶液的0.01%(體積分數(shù))。暴露期間，每24 h換一次暴露溶液。暴露結束后，使用MS-222麻醉劑將斑馬魚致死，并在冰上采集斑馬魚腦組織。每5個魚腦作為一個樣本，并在采集完畢后迅速放入－80℃冰箱凍存。

1．2．5 樣品前處理

取5個斑馬魚的腦組織(約20 mg)，置于1.5 mL離心管中，加入180 μL甲醇，在冰上進行充分研磨，將研磨液轉移至5 mL離心管中;加入180 μL甲醇沖洗管壁殘留并將其合并至5 mL離心管中;加入1.2 mL氯仿，渦旋混勻 1 min，超聲提取 3 min;加入240 μL水混勻，靜置分層，取氯仿層至5 mL離心管中，重復此提取步驟;合并氯仿層，室溫條件下氮吹至干，用1 mL甲醇復溶，過0.2 μm 濾膜，然后上機測定。本研究中對照組及實驗組分別設置7個平行樣品。

1．2．6 數(shù)據(jù)處理

借助于Simca-P 13.0軟件進行多元統(tǒng)計分析，然后根據(jù)VIP值大于1篩選出具有差異變化的脂質。將篩選出的脂質數(shù)據(jù)導入SPSS 16.0軟件進行顯著性分析和組間差異分析，最后用GraphPad軟件進行作圖。

2 結果與分析

2．1 鞘脂檢測方法

2．1．1 色譜條件選擇

在鞘脂分子的結構中存在一分子長鏈脂肪酸、一分子鞘氨醇及一分子極性頭醇。結合鞘脂的結構，選擇流動相A為甲酸甲醇水組合，B為甲酸甲醇異丙醇組合，為使46種鞘脂實現(xiàn)良好分離，不斷調節(jié)流動相各部分比例，在1．2．2節(jié)梯度條件下，46種鞘脂的色譜峰在14 min內(nèi)實現(xiàn)了良好分離(見圖1)。

圖1 46種鞘脂標準品的提取離子流圖Fig．1 Extracted ion chromatograms of a mixture of the 46 sphingolipid standards

2．1．2 質譜條件選擇

在電噴霧質譜的正離子模式條件下，采用單一標準品針泵進樣，找到該鞘脂的母離子和子離子。由掃描結果可知，鞘脂的準分子離子峰多為［M+H］+，且同一類別的鞘脂離子碎片具有一定的碎裂規(guī)律。為使得鞘脂分子母離子和子離子的響應提高，對DP和CE進行了優(yōu)化。DP主要在母離子掃描過程中起作用，過高和過低都會影響離子的豐度。根據(jù)每一種鞘脂性質的不同，我們分別優(yōu)化了DP，以確保母離子響應，從而提高檢測靈敏度。CE是指在子離子掃描過程中，對母離子所施加的碰撞能量，CE的高低直接影響到子離子碎片的響應。在本研究中，我們對每一種鞘脂的CE都分別進行了優(yōu)化，從而保證子離子碎片掃描的準確度和高響應性。隨后，我們采用MRM模式進行46種鞘脂標準品的掃描，并對其他相關參數(shù)進行微調，提高系統(tǒng)的靈敏度，并確定每一種鞘脂分子的保留時間，然后采用Schedule MRM模式進行掃描，進一步提高系統(tǒng)靈敏度。

2．1．3 基質效應

基質效應的考察是采用溶劑標準曲線和基質標準曲線進行比較計算的，即:基質效應=(b基質標/b溶劑標－1)×100%，其中b基質標表示基質標準曲線的斜率，b溶劑標表示溶劑標準曲線的斜率。基質效應小于－20%時，表現(xiàn)出基質抑制。當基質效應大于20%時，表現(xiàn)出基質增強。結果(見表2)顯示，18種鞘脂表現(xiàn)出基質抑制效應，6種鞘脂表現(xiàn)出基質增強效應。在該提取條件下，除鞘脂以外的其他脂質也會從斑馬魚腦組織中溶出，如甘油磷脂等，從而對鞘脂精確定量造成影響，導致個別鞘脂的基質效應較強。尤其是梯度洗脫程序的10～14 min范圍內(nèi)，在色譜柱上保留較強的鞘脂、磷脂或者其他物質因為流動相中的高比例有機溶劑存在(＞90%的0.1%甲酸甲醇-異丙醇)，會在運行后期形成更多的共流出物，從而在質譜上表現(xiàn)出更強的基質響應。所以，一方面我們利用色譜分離，將干擾物與目標物分開，將鞘脂的保留時間調至4 min以后，以提高鞘脂分離度來降低基質干擾;另一方面，我們將進樣量調至1 μL，從而降低基質干擾［24］，故可使用溶劑標準曲線進行定量分析。

2．2 方法學考察

2．2．1 線性關系

將46種鞘脂混合標準溶液用甲醇稀釋至質量濃度為 0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列標準溶液，以各鞘脂的質量濃度為橫坐標，色譜峰面積響應為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸分析并計算相關系數(shù)。由表2可知，這46種鞘脂的相關系數(shù)(R)為0.991 3～0.999 9，說明線性關系均較好，滿足檢測要求。

將46種鞘脂的混合標準溶液上機測定，以信噪比(S/N)為3的鞘脂質量濃度為LOD，S/N為10的鞘脂質量濃度為定量限。由結果可知，其中44種鞘脂的檢出限低于1 μg/L，43種鞘脂的定量限低于 2 μg/L。

表2 46種鞘脂的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢出限(LODs)、定量限(LOQs)和基質效應Table 2 Linear equations，correlation coefficients(R)，linear ranges，limits of detection(LODs)，limits of quantification(LOQs)，and matrix effects of the 46 sphingolipids

表2 (續(xù))Table 2 (Continued)

2．2．2 回收率和精密度

在斑馬魚腦組織勻漿中分別添加3個水平的混合標準溶液進行回收率實驗，回收率的計算是采用空白樣品背景扣除法，得到每種鞘脂的平均回收率為82.4%～117.9%，相對標準偏差(RSD)為0.3%～14.4%，見表3。

表3 加標斑馬魚腦組織樣品中46種鞘脂的回收率和RSD(n=5)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of the 46 sphingolipids spiked in adult zebrafish brain samples(n=5)

表3 (續(xù))Table 3 (Continued)

2．3 鞘脂組學分析

2．3．1 數(shù)據(jù)分析

將46種神經(jīng)鞘脂的數(shù)據(jù)借助于6500 MultiQuant定量軟件進行定量，然后將定量結果導入Simca-P軟件進行多元統(tǒng)計分析。為探究rac-IBU、R-(－)-IBU和S-(+)-IBU的暴露影響，首先進行了主成分分析(PCA)，R2X=0.876，Q2=0.573，模型良好，見圖2，可以看出，對照組、rac-IBU、R-(－)-IBU和S-(+)-IBU暴露組樣品得到了很好的分離。說明布洛芬暴露確實會導致斑馬魚腦組織中的鞘脂代謝受到影響。為了進一步找到布洛芬暴露影響的靶標脂質，建立了3組偏最小二乘(OPLSDA)模型(見圖3a，b，c)，這3個模型參數(shù)均滿足要求，且經(jīng)驗證后，參數(shù)顯示模型未出現(xiàn)過擬合。根據(jù)VIP值＞1，分別找到存在差異的脂質分子，并建立了韋恩圖模型(見圖3d)，以分析rac-IBU及對映體對斑馬魚腦組織中的鞘脂種類的立體選擇性影響。將篩選出的16種VIP值＞1的鞘脂分子定量結果導入SPSS軟件中進行顯著性差異分析及多組間差異分析。結果見圖4。其中*代表p＜0.05，＊＊代表p＜0.01，不同的字母表示代表組間存在差異，而相同字母代表不存在差異。以圖3中的12∶0 SM(d18∶1/12∶0)為例，rac-IBU暴露組與 R-(－)-IBU暴露組的字母分別為b和c，說明這兩組之間存在顯著差異，而R-(－)-IBU暴露組和S-(+)-IBU暴露組皆以c表示，說明這兩組之間不存在顯著差異。

圖 2 對照組、rac-IBU、R-(－)-IBU和S-(+)-IBU暴露組腦組織樣品的主成分分析結果Fig．2 3D PCA plot of control-，rac-IBU-，R-(－)-IBU-，and S-(+)-IBU-treated brain tissue samples

2．3．2 潛在生物標志物的變化趨勢及生理學意義分析

圖3 rac-IBU、R-(－)-IBU和S-(+)-IBU暴露組與對照組相比的正交偏最小二乘分析及韋恩圖分析結果Fig．3 Orthogonal partial least square-discriminate analysis(OPLS-DA)plots of rac-IBU-，R-(－)-IBU-，and S-(+)-IBU-treated samples vs controls，and a Venn plot for IBU-treated samples

圖4 16種存在顯著差異的鞘脂在不同組別間的含量變化Fig．4 Content changes of 16 sphingolipids with significant difference among different ibuprofen-treated groupsBars without the same letter(a，b，and c)were significantly different based on the Duncan post hoc test and Dunnett post hoc comparison;*p＜0.05 and ＊＊p＜0.01．

借助代謝組學數(shù)據(jù)分析方法，篩選出16種存在顯著差異的鞘脂(見圖4)?？傮w來看，這16種神經(jīng)鞘脂含量均發(fā)生了上調。其中C16 dihyrdroceramide(d18 ∶0/16 ∶0)、17 ∶0 SM(d18 ∶1/17 ∶0)、C16 lactosyl(β)ceramide(d18 ∶1/16 ∶0)、18 ∶0 SM(d18 ∶1/18 ∶0)、16 ∶0 SM(d18 ∶1/16 ∶0)、C24 ceramide-1-phosphate(d18∶0/24∶0)和 C18 glucosyl(β)ceramide(d18∶1/18∶0)在R-(－)-IBU暴露組中上調最高。Satoshi等［25］研究發(fā)現(xiàn)，16∶0 SM(d18∶1/16∶0)上調會顯著增加葡萄糖的消耗量和乳酸的生成量，從而增加ATP產(chǎn)生，而且發(fā)現(xiàn)，16∶0 SM(d18∶1/16∶0)可以通過激活糖酵解途徑來增加ATP的產(chǎn)生。在本研究中，經(jīng)布洛芬暴露后，16∶0 SM(d18∶1/16∶0)的含量出現(xiàn)明顯上調，說明布洛芬會導致斑馬魚成魚腦組織中的能量代謝發(fā)生紊亂。而 ceramide-1-phosphate(d18∶0/24∶0)的升高與脂肪變性有關，說明布洛芬暴露會影響斑馬魚腦組織中的脂質代謝［26］。此外，Skotland 等［27］發(fā)現(xiàn) C16 lactosyl(β)ceramide(d18∶1/16 ∶0)可作為診斷前列腺癌的潛在生物標志物。12∶0 SM(d18∶1/12∶0)在 S-(+)-IBU暴露組中上調最高。而 C16 ceramide(d18 ∶1/16 ∶0)、C17 ceramide(d18 ∶1/17 ∶0)、C18 ceramide(d18 ∶1/18 ∶0)、C24 ∶1 lactosyl(β)ceramide(d18 ∶1/24∶1(15Z))、C16 glucosyl(β)ceramide(d18 ∶1/16 ∶0)、C20 ceramide(d18 ∶1/20 ∶0)、C22 ceramide(d18 ∶1/22 ∶0)和C24∶1 ceramide(d18 ∶1/24 ∶1(15Z))在 rac-IBU暴露組中的含量上調最高。神經(jīng)酰胺，尤其是葡糖神經(jīng)酰胺和乳糖神經(jīng)酰胺的累積會抑制載體蛋白E的產(chǎn)生，從而導致巨噬泡沫細胞中膽固醇的累積。其中C16 ceramide(d18∶1/16∶0)與動脈粥樣硬化癥狀密切相關［28］。本研究結果說明，布洛芬暴露會影響斑馬魚腦組織中的膽固醇代謝。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)鞘磷脂與細胞的內(nèi)吞作用、蛋白質分選及其他細胞核的功能調控密切相關。而且，神經(jīng)酰胺還可作為心血管疾病的風險評估因子，在心血管疾病監(jiān)控中具有重要的研究意義［29］。Rye 等［30］研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)鞘磷脂不僅會影響盤狀和球狀重組高密度脂蛋白的結構，還會抑制盤狀重組高密度脂蛋白形成過程中的卵磷脂-膽固醇酰基轉移酶反應，而重組高密度脂蛋白可用于治療動脈粥樣硬化和其他心血管疾病。神經(jīng)酰胺與動物的應激反應、細胞免疫、細胞生長和變異以及細胞凋亡有著密切的聯(lián)系［31，32］。本研究中，有一種神經(jīng)酰胺-1-磷酸鹽發(fā)生了顯著變化，神經(jīng)酰胺-1-磷酸鹽是神經(jīng)酰胺在特定的神經(jīng)酰胺激酶的磷酸化作用下產(chǎn)生的。而且神經(jīng)酰胺-1-磷酸鹽也是花生四烯酸和前列腺素類物質合成的誘導劑［33］。以上結果說明長期布洛芬暴露會導致斑馬魚成魚腦組織中的鞘脂代謝發(fā)生紊亂，且外消旋體及其手性對映體產(chǎn)生的毒性影響表現(xiàn)出明顯的選擇性。

3 結論

本研究基于超高效液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用的鞘脂組學方法，分析了經(jīng)rac-布洛芬及其手性對映體暴露的斑馬魚腦組織中鞘脂變化。發(fā)現(xiàn)布洛芬長期暴露會導致包括神經(jīng)鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、乳糖神經(jīng)酰胺、葡糖神經(jīng)酰胺以及神經(jīng)酰胺-1-磷酸鹽等5類鞘脂發(fā)生了代謝紊亂，表明斑馬魚腦組織中的神經(jīng)功能、能量代謝和過敏免疫系統(tǒng)受到影響，且R-(－)-布洛芬和S-(+)-布洛芬暴露組中受影響的鞘脂種類和含量表現(xiàn)出明顯的選擇性，可作為水生生物布洛芬污染判別的潛在生物標志物。