沙芥屬植物活性氧清除系統(tǒng)對干旱脅迫的響應(yīng)

鄭清嶺，楊忠仁，張鳳蘭，張曉艷，郝麗珍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，內(nèi)蒙古野生特有蔬菜種質(zhì)資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，呼和浩特 010019)

沙芥屬(PugioniumGaertn)植物屬于十字花科二年生草本植物，為亞洲中部蒙古高原沙地所特有，包含沙芥[Pugioniumcornutum(L.) Gaertn.]和斧形沙芥(PugioniumdolabratumMaxim.) 2個種[1]，多生長在干旱或半干旱地區(qū)的荒漠沙地上。該屬植物根系發(fā)達且分布較深，葉片披針狀線形，果實為具翅刺短角果，屬于肉質(zhì)多漿類旱生植物，能適應(yīng)干旱環(huán)境，為典型的沙生植物類群[2]，是一類優(yōu)質(zhì)抗旱種質(zhì)資源，也是一類集食用、飼用、藥用、保健和防風固沙等功能于一體的沙生蔬菜[3]。迄今，前人的研究多集中于沙芥葉片解剖結(jié)構(gòu)[4]、光合特性[5]、根系形態(tài)[6]、轉(zhuǎn)錄組水平[7]等對干旱脅迫的響應(yīng)，有關(guān)沙芥屬模式種沙芥和珍稀瀕危種斧形沙芥的抗旱性比較的研究較少，僅限于自然干旱脅迫條件下沙芥和斧形沙芥幼苗生長指標以及葉片生理特性的比較，并利用其平均隸屬度和綜合抗旱系數(shù)評價二者抗旱性[8]，而本研究從沙芥屬植物活性氧清除系統(tǒng)方面深入分析不同干旱脅迫程度下根和葉中活性氧水平、抗氧化酶活性和抗氧化劑含量的變化，并利用隸屬函數(shù)法和抗旱系數(shù)法綜合評價沙芥和斧形沙芥抗旱性強弱，為沙芥屬植物的抗旱栽培、抗旱育種以及種質(zhì)資源評價提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

將發(fā)芽的沙芥和斧形沙芥種子點播在塑料盆(內(nèi)徑13 cm，高13 cm，質(zhì)量0.05 kg)中，置于智能溫室。培養(yǎng)基質(zhì)為過篩沙子和腐熟羊糞(4∶1,V/V)，混合后土壤初始含水量為3.68%±0.18%，田間持水量為21.45%±0.39%。出苗后正常水分管理，采用稱重法保持土壤相對含水量(SRWC, 占田間持水量的百分數(shù))為70%～75%。植株六葉一心時自然干旱至不同處理水平后，稱重控制土壤水分含量，并于每天18:00左右補充水分至不同干旱脅迫水平，干旱處理10 d時(不同干旱脅迫處理的植株葉片受害程度出現(xiàn)明顯差異)結(jié)束試驗，次日早晨7:30左右采取植株葉片和根系樣品，測定相關(guān)生理指標。

沙芥和斧形沙芥各設(shè)正常供水對照(CK)、輕度干旱脅迫(light stress, LS)、中度干旱脅迫(moderate stress, MS)和重度干旱脅迫(severe stress, SS)的4個土壤水分處理，每個處理20盆(圖1)。其中，沙芥CK、LS、MS、SS水平的SRWC分別為73.64%±4.42%、52.17%±1.11%、46.08%±0.92%、34.83%±2.68%；斧形沙芥相應(yīng)處理的SRWC分別為74.29%±2.07%、54.00%±3.10%、44.95%±1.48%、30.07%±0.61%。

1.2 測定指標與方法

1.2.2抗氧化酶活性超氧化物歧化酶(SOD, EC 1.15.1.1)活性采用氮藍四唑法[12]測定；過氧化物酶(POD, EC 1.11.1.7)活性采用愈創(chuàng)木酚法[13]測定；過氧化氫酶(CAT, EC 1.11.1.6)活性采用紫外分光光度計法[13]測定；抗壞血酸過氧化物酶(APX, EC 1.11.1.11)活性參考Nakano等[14]的方法測定；谷胱甘肽還原酶(GR, EC 1.6.4.2)活性參考Ma等[15]的方法測定；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST, EC 2.5.1.18)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX, EC 1.11.1.9)活性根據(jù)南京建成公司試劑盒(貨號A004, A005; 下同)提供的方法測定。

1.2.3抗氧化劑含量抗壞血酸(ascorbic acid, AsA)含量采用Fe3+還原法[16]測定；谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)含量參考Griffith等[17]的方法測定；維生素E(vitamin E, VE)含量測定根據(jù)南京建成試劑盒(A008)提供的方法；類胡蘿卜素(carotenoids, CAR)含量測定采用95%乙醇提取法[12]。

1.2.4總抗氧化能力總抗氧化能力(total anti-oxidant capacity, T-AOC)的測定按南京建成試劑盒(A015)的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

所有指標測定均4次重復(fù)，用Excel 2013整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，用Origin 9.0軟件作圖。采用謝小玉等[18]的方法，計算各指標的隸屬函數(shù)值和抗旱系數(shù)，進而計算各處理的平均隸屬度和綜合抗旱系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對沙芥和斧形沙芥根葉中活性氧及丙二醛含量的影響

2.2 干旱脅迫對沙芥和斧形沙芥根葉中抗氧化酶活性的影響

表1顯示，隨著干旱脅迫程度的加劇，沙芥和斧形沙芥的根葉中POD、APX、GST活性及葉中GR活性先升高后降低，它們?nèi)~中SOD活性以及根中GR、GPX活性先降低后升高，其根葉CAT活性、葉中的GPX活性和根中SOD活性逐漸升高。其中，根和葉中SOD、POD、CAT活性在各干旱處理下均表現(xiàn)為斧形沙芥高于沙芥，而沙芥和斧形沙芥根中POD活性均高于葉中，其CAT活性均低于葉中；根和葉中APX活性均在中度干旱脅迫時達到最大值，其根中APX活性表現(xiàn)為沙芥高于相應(yīng)斧形沙芥；沙芥葉中GR活性在各處理下均低于相應(yīng)斧形沙芥，沙芥根GR活性在對照、輕度干旱處理時高于相應(yīng)斧形沙芥，而在中度、重度干旱時低于相應(yīng)斧形沙芥；沙芥葉中GST活性在各處理下均高于相應(yīng)斧形沙芥，而其根GST活性在重度干旱時低于相應(yīng)斧形沙芥，沙芥和斧形沙芥葉中GST活性分別在輕度干旱和中度干旱脅迫時顯著升高并達到最大值；沙芥根和葉中GPX活性在各干旱處理下均高于相應(yīng)的斧形沙芥。以上結(jié)果說明斧形沙芥的抗氧化酶活性高于沙芥，在活性氧清除系統(tǒng)中能清除更多的ROS，同時減少MDA的產(chǎn)生，更能適應(yīng)干旱環(huán)境。

CK、LS、MS、SS分別表示對照、輕度、中度、重度干旱脅迫處理;下同圖1 不同干旱脅迫處理的沙芥和斧形沙芥CK, LS, MS and SS represented control, light drought stress and moderate drought stress and severe drought stress, respectively; The same as belowFig.1 The P. cornutum and P. dolabratum under drought stress

LPC、LPD、RPC、RPD分別代表沙芥葉、斧形沙芥葉、沙芥根、斧形沙芥根；同一材料內(nèi)不同小寫字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異；下同圖2 干旱脅迫下沙芥和斧形沙芥幼苗活性氧及丙二醛含量的變化LPC, LPD, RPC and RPD represented P. cornutum leaves, P. dolabratum leaves, P. cornutum roots and P. dolabratum roots, respectively; Different normal letters within the same material indicated significant difference among treatments at 0.05 level; The same as belowFig.2 The ROS and MDA contents of P. cornutum and P. dolabratum seedling under drought stress

2.3 干旱脅迫對沙芥和斧形沙芥根葉中抗氧化劑含量的影響

從圖3可知，隨著干旱脅迫程度的加劇，沙芥和斧形沙芥的根和葉中AsA含量先增加后降低，GSH含量逐漸升高，CAR含量逐漸降低， 而它們VE含量在葉中逐漸升高，在根中逐漸降低。其中，各干旱處理葉中AsA含量在沙芥與相應(yīng)斧形沙芥間較為相近，各處理根中AsA含量均表現(xiàn)為沙芥低于相應(yīng)斧形沙芥；沙芥和斧形沙芥的根葉中AsA含量均在中度干旱脅迫時達到最大值，且斧形沙芥根和葉中AsA含量又均高于相應(yīng)沙芥。在相同處理下，沙芥葉中GSH含量均明顯低于相應(yīng)斧形沙芥，而其根中GSH含量與相應(yīng)斧形沙芥相近；沙芥和斧形沙芥根、葉中GSH含量均在重度干旱脅迫時達到最大值，且大多顯著高于其余處理。沙芥和斧形沙芥的葉中VE含量均在中度干旱脅迫時達到最大值，且顯著高于對照，并在相同處理下表現(xiàn)為沙芥低于相應(yīng)斧形沙芥；沙芥和斧形沙芥根中VE含量分別在中度和重度脅迫下開始比對照顯著降低。沙芥和斧形沙芥的根CAR含量在各處理下均較低且相近，而它們?nèi)~中CAR含量大幅高于根中，沙芥均明顯低于相應(yīng)斧形沙芥。斧形沙芥的AsA和GSH含量大于或者接近于沙芥，說明斧形沙芥比沙芥合成更多的AsA和GSH，其植物體內(nèi)AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)能清除更多的ROS，從而減輕ROS傷害。

圖3 干旱脅迫下沙芥和斧形沙芥根葉中抗氧化劑含量的變化Fig.3 The antioxidant contents in leaves and roots of P. cornutum and P. dolabratum seedling under drought stress

2.4 干旱脅迫對沙芥和斧形沙芥根葉中總抗氧化能力的影響

沙芥和斧形沙芥的根和葉中總抗氧化能力(T-AOC)均隨著干旱脅迫程度的加劇而逐漸增強，且均在中度干旱時比對照顯著升高，在重度脅迫時仍保持在顯著較高水平(圖4)。其中，沙芥和斧形沙芥的葉T-AOC在輕度、中度、重度干旱時分別比對照升高了16.56%、83.87%、98.86%和38.54%、105.99%、130.48%，它們根中T-AOC分別比對照升高了15.35%、18.86%、48.03%和9.12%、48.89%、55.47%。沙芥的根和葉T-AOC在各干旱處理下均不同程度地低于相應(yīng)的斧形沙芥，且在中度和重度干旱時的增加幅度小于斧形沙芥，所以斧形沙芥的根、葉總抗氧化能力均強于沙芥，其抗旱能力強于沙芥。

2.5 沙芥和斧形沙芥抗旱性綜合評價

沙芥和斧形沙芥在不同干旱脅迫下的平均隸屬度和綜合抗旱系數(shù)如表2所示。沙芥葉的平均隸屬度在輕度干旱時大于斧形沙芥，而此時其根的平均隸屬度小于斧形沙芥；沙芥葉、根的平均隸屬度在中度、重度干旱時均小于斧形沙芥；沙芥葉和根的平均隸屬度之和在輕度干旱時大于斧形沙芥，而在中度、重度干旱時小于斧形沙芥。同時，沙芥葉、根的綜合抗旱系數(shù)及其葉、根的綜合抗旱系數(shù)之和在輕度干旱時均大于斧形沙芥，而其在中度、重度干旱時均小于斧形沙芥。所以，在中度、重度干旱脅迫條件下，斧形沙芥的抗旱性強于沙芥。

圖4 干旱脅迫下沙芥和斧形沙芥幼苗根葉中總抗氧化能力(T-AOC)的變化Fig.4 The total anti-oxidant capacity (T-AOC) in leaves and roots of P. cornutum and P. dolabratum seedling under drought stress

3 討 論

表2 沙芥和斧形沙芥各處理的平均隸屬度和綜合抗旱系數(shù)

植物ROS的積累會促進SOD、CAT、POD等抗氧化酶活性的增強，已有研究表明，植物根葉的SOD、CAT和POD活性在干旱脅迫加重過程中均先升高后降低，如沙棘葉片[20]、玉米葉片和根系[23]、鴨茅葉片和根系[21]，本試驗中沙芥和斧形沙芥的根和葉中POD活性隨著干旱脅迫加劇先升高后降低，與玉米[24]、鴨茅[21]相一致；其根和葉中SOD和CAT活性總體上呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，與紅砂葉片[25]、沙棗葉片[26]變化趨勢一致。同時，沙芥和斧形沙芥在受到干旱脅迫時，根和葉中SOD活性、葉中CAT活性和根中POD活性較高，可能是清除ROS的主要的抗氧化酶。在不同程度干旱脅迫下，斧形沙芥的根和葉中SOD、CAT和POD活性均高于相同處理的沙芥，所以斧形沙芥的抗氧化酶活性強于沙芥。另外，植物中GST主要在細胞質(zhì)中參與植物抵抗氧化脅迫的反應(yīng)，能解除羥基過氧化物的毒性[27]。GPX可直接清除膜脂過氧化物而修復(fù)氧化脅迫對膜造成的傷害[28]，在清除脂類和烷基過氧化物的氧化代謝方面具有重要作用[29]。本試驗中沙芥和斧形沙芥根和葉中GST活性均隨干旱脅迫加劇呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，并在輕度或者中度干旱時達到最大值，說明輕度或中度干旱脅迫促進了GST活性增強，參與了抗氧化保護系統(tǒng)；而重度干旱時GPX活性增加，可能是由于沙芥屬植物在受到重度干旱脅迫時質(zhì)膜傷害加重所致。

植物ROS的積累也會促進AsA、GSH、VE等抗氧化劑含量的增加，隨著干旱脅迫程度加劇，本研究中沙芥和斧形沙芥根和葉中AsA含量先增加后降低，GSH含量逐漸升高，CAR含量逐漸降低，VE含量在葉中逐漸增加而根中逐漸降低。在干旱脅迫過程中，蘋果葉片[30]、新疆野蘋果和平邑甜茶葉片[31]的AsA含量均先上升后下降，冰草葉片[28]、小麥幼苗[32]的GSH含量呈上升趨勢，花棒苗[33]重度干旱脅迫時CAR含量顯著降低。這些植物在干旱脅迫下AsA、GSH和CAR的變化趨勢均與沙芥屬植物變化一致。但花棒苗[33]的AsA含量在重度干旱脅迫下顯著增加，GSH含量均顯著降低；小麥幼苗[32]、白三葉葉片[34]的AsA含量呈下降趨勢，蘋果葉片[30]、白三葉葉片[34]的GSH先升高后降低，紅砂葉片[25]以及冰草[28]、無芒隱子草[28]、白羊草葉片[28]的CAR含量增加，與沙芥屬植物在干旱脅迫下的變化趨勢不一致，充分說明不同種屬的植物抗氧化劑對干旱脅迫的響應(yīng)有差異。沙芥和斧形沙芥的根和葉中AsA含量在重度干旱時顯著下降，可能是因為合成AsA途徑的關(guān)鍵酶合成受到了抑制；斧形沙芥的根和葉中AsA和GSH含量均大于沙芥，能更好地參與AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)清除ROS的危害，這可能是斧形沙芥抗旱性強的另一個原因。

抗氧化酶和抗氧化劑共同反映了植物體內(nèi)的總抗氧化能力，而總抗氧化能力(T-AOC)是機體內(nèi)所有物質(zhì)抗氧化能力的總和，是衡量機體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標，測定總抗氧化力可以了解植物防御體系受干旱脅迫影響的情況[35]。沙芥和斧形沙芥的根和葉中T-AOC均隨著干旱脅迫程度加劇逐漸增強，這一結(jié)果與干旱脅迫下空心蓮子草T-AOC的表現(xiàn)[36]相一致。各種抗氧化酶和抗氧化劑的協(xié)調(diào)作用在維持低水平的ROS和保護植物細胞免受氧化脅迫傷害中具有重要作用[28]。干旱脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)ROS產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)沙芥和斧形沙芥的SOD、POD、CAT、APX、GR、GST、GPX等抗氧化酶活性以及AsA、GSH、VE等抗氧化劑含量的先后升高，抗氧化酶和抗氧化劑協(xié)調(diào)作用共同清除ROS，使ROS的產(chǎn)生與清除趨于平衡，避免或減輕植株受到傷害。由于沙芥葉、根各處理的T-AOC均低于相同處理的斧形沙芥，所以斧形沙芥在干旱脅迫下表現(xiàn)出更強的抗干旱脅迫能力。另外，鄭清嶺等[8]根據(jù)自然干旱脅迫第12天時的沙芥和斧形沙芥幼苗的生長和葉片生理指標的隸屬函數(shù)值和抗旱系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，重度干旱下的斧形沙芥的抗旱性強于沙芥。本試驗中通過人工模擬干旱的方法再次證實了該結(jié)論，同時根據(jù)沙芥和斧形沙芥的根和葉在不同干旱脅迫程度下各指標的平均隸屬度以及綜合抗旱系數(shù)可知，輕度干旱脅迫下沙芥抗旱性強于斧形沙芥，中度和重度干旱脅迫下斧形沙芥的抗旱性強于沙芥。