不同光周期下馥郁滇丁香 ‘香妃’的成花反應(yīng)以及花芽分化進程的解剖學(xué)研究

萬友名，馬 宏，趙振剛，李太強，劉雄芳，劉秀賢，李正紅

(中國林業(yè)科學(xué)研究院 資源昆蟲研究所，昆明 650224)

馥郁滇丁香(Luculiagratissima)為茜草科(Rubiaceae)滇丁香屬(Luculia)常綠灌木或喬木，分布于中國西南部的西藏高原東南邊緣以及毗鄰尼泊爾和緬甸的地域，自然花期在8～12月[1]。本屬植物具花期長、花色艷麗芳香、花序大且密集、四季常綠、葉片翠綠光亮、株型美觀等特性[2-3]，是一種具有較高觀賞價值的新興多年生木本花卉。目前，中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所已從馥郁滇丁香野生種群的突變單株中選育出1個優(yōu)良無性系，并于2018年4月以‘香妃’(證書號：云林園植新登第20180006號)為名，在云南省林業(yè)廳園藝植物新品種注冊登記辦公室注冊登記成新品種。有關(guān)馥郁滇丁香的研究僅見在分子標記[1]、花香化合物成分分析[4]、花部形態(tài)及花粉管萌發(fā)特性[5]等方面報道。而對于商品化生產(chǎn)至關(guān)重要的花期調(diào)控的相關(guān)研究尚未見報道，甚至在本屬植物的其他幾個種中也無相關(guān)報道。

成花是植物生活史中的一個重要發(fā)育過程。目前，在一些一年生的植物中，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)，成花的機理已基本探明[6]，而多年生的木本植物仍不太清楚[7]。大量的研究表明，植物的成花是由許多復(fù)雜的調(diào)控途徑所控制，這些途徑主要包括光周期途徑、春化途徑、自主途徑、赤霉素途徑及年齡途徑等[8]。對于光周期敏感的植物，光周期是控制成花的主導(dǎo)因素，因此，光周期調(diào)控也就成為了花期調(diào)控的重要手段之一。研究表明，同一種植物的不同品種間都可能存在光周期作用類型的不同[9-10]。因此，在對一個新培育品種進行產(chǎn)業(yè)化栽培之前，系統(tǒng)掌握其成花的光周期反應(yīng)特性，對優(yōu)化花期調(diào)控的數(shù)字化模型以及合理安排生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。另外，花芽分化特性研究是花期調(diào)控的基礎(chǔ)，掌握花芽分化特性對花卉的生產(chǎn)具有同等重要的指導(dǎo)意義。通過了解花卉的花芽分化特性，可采取相應(yīng)的栽培管理措施來控制花芽分化的時期、數(shù)量和質(zhì)量，為生產(chǎn)高品質(zhì)的花卉奠定基礎(chǔ)[11]。馥郁滇丁香‘香妃’，系本課題組前期根據(jù)其自然花期所處的時節(jié)將其假定為短日照植物，并采用暗中斷法對其進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，午夜4 h暗中斷能一直抑制馥郁滇丁香‘香妃’的成花。而此結(jié)果正是一些短日照植物所具有的特性。然而，馥郁滇丁香‘香妃’是否屬于短日照植物，目前系統(tǒng)的研究在國內(nèi)外尚未見報道。本研究以馥郁滇丁香品種‘香妃’為試驗材料，通過人工設(shè)置不同的光周期及采用遷光法[12]對其進行處理，并采用石蠟切片法對誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)光周期條件下的花芽形態(tài)分化進程進行觀察，以期系統(tǒng)地掌握馥郁滇丁香‘香妃’的成花光周期效應(yīng)及花芽形態(tài)分化特征，為商品化生產(chǎn)中的花期調(diào)控及高品質(zhì)盆花栽培奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗材料的準備參照Ren等[13]的方法。于2016年12月15日從馥郁滇丁香‘香妃’植株上采集具2個莖節(jié)且?guī)в许斞康闹l進行扦插。生根的苗木移栽至花盆并置于溫室中培養(yǎng)。為防止短日照對幼苗的誘導(dǎo)，當幼苗新長出2～3個莖節(jié)時，去除所有植株的頂端分生組織，并置于高壓鈉燈補光的暗中斷溫室中培養(yǎng)(22:00～2:00，暗中斷4 h)。同時，為考慮分生個體發(fā)育年齡可能對成花產(chǎn)生的影響[14]，在自然環(huán)境中放置部分植株設(shè)為對照，并以對照出現(xiàn)花芽分化的時間作為各項光周期試驗處理的起始時間。

1.2 方 法

1.2.1不同光周期下的成花反應(yīng)參照胡惠蓉等[15]、王琴等[16]的方法設(shè)置不同的光周期處理。采用黑白膜遮光、白熾燈補光營造出光照/黑暗分別為16 h/8 h、14 h/10 h、12 h/12 h、10 h/14 h、8 h/16 h的光周期環(huán)境，試驗棚內(nèi)植株頂部的光照強度為1.8～2.3 μmol·m-2·s-1。于2017年8月10日(部分對照植株開始出現(xiàn)花芽分化)，從4 h暗中斷環(huán)境中選取栽培容器口徑為18 cm的盆栽植株移入不同光周期處理環(huán)境中，每處理30盆。供試植株每株分枝長度大于5 cm的分枝數(shù)一致。每隔3～5 d 觀察記錄成花的植株數(shù)、單株花序數(shù)及花朵數(shù)、處理起始至單株現(xiàn)蕾天數(shù)和第一朵花開放的天數(shù)。

1.2.2誘導(dǎo)光周期下處理不同時間的成花反應(yīng)采用遷光法進行處理。從4 h暗中斷環(huán)境中選取栽培容器口徑為20 cm的盆栽植株移入光照/黑暗為10 h/14 h的光周期中處理，分別處理5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d后又將植株移回到4 h暗中斷環(huán)境中，每處理30盆。供試植株每株分枝長度大于5 cm的分枝數(shù)一致。每隔3～5 d 觀察記錄成花的植株數(shù)、單株花序數(shù)及花朵數(shù)、處理起始至單株現(xiàn)蕾天數(shù)和第一朵花開放的天數(shù)。

1.2.3誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)光周期下花芽分化進程的形態(tài)觀察將4 h暗中斷環(huán)境中培養(yǎng)的盆栽植株移入光照/黑暗為10 h/14 h的光周期環(huán)境中處理。自處理開始，每隔3～5 d隨機選取10株植株采集主枝上的頂芽1個，并將每個時間點采集的10個頂芽立即用FAA固定。與此同時，每次采用相同的方法從4 h暗中斷環(huán)境中培養(yǎng)的植株上采集10個頂芽用FAA固定液固定。采樣自處理開始至花朵開放。經(jīng)FAA固定的材料，采用常規(guī)石蠟切片法制片，切片厚度8～10 μm，番紅-固綠染色，中性樹膠封片，Nikon Eclipe E800型光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。

1.2.4數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010 進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 16.0 軟件進行方差分析和Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光周期下的成花反應(yīng)

16 h/8 h光周期處理下一直沒有植株成花，表明該光周期為馥郁滇丁香‘香妃’的非誘導(dǎo)光周期。其余4個光周期都能不同程度地誘導(dǎo)馥郁滇丁香‘香妃’成花(表1)。從植株成花上看，14 h光照處理下，有10%的植株成花；當光照長度為12 h時，處理的植株能全部成花。由此說明，馥郁滇丁香‘香妃’屬于短日照植物，其臨界日長約為14 h。從現(xiàn)蕾和始花時間上看，4個誘導(dǎo)光周期間均無顯著差異，說明‘香妃’的小花一旦在誘導(dǎo)光周期下誘導(dǎo)啟動，其發(fā)育不受光照長短的影響。另外，觀察發(fā)現(xiàn)，植株在16 h/8 h的非誘導(dǎo)光周期下處理的時間超過4個誘導(dǎo)光周期下的始花時間2倍之后，仍處于營養(yǎng)芽狀態(tài)(圖版Ⅰ，A)，因此，按Damann等[17]對植物光周期作用性質(zhì)的判斷標準，可將馥郁滇丁香‘香妃’判定為質(zhì)性或?qū)Ｐ远倘照罩参?。從單株的花序和花朵形成上看，隨著光照長度的縮短，其數(shù)量逐漸增多，并在12、10 h光照長度下達到最多，且二者間無顯著差異，隨后在8 h的光照長度下降低，表明并非光照長度越短越有利于花序和小花形成，而只有在適宜的光照長度下才有利于花序和小花的形成。此外，在14 h光照長度下的花序數(shù)和花朵數(shù)的平均值均小于其標準差，說明馥郁滇丁香‘香妃’在該光照長度下誘導(dǎo)不夠充分，從而造成植株間的花序和花朵數(shù)差異較大。因此，由以上分析可知，馥郁滇丁香‘香妃’成花的適宜光照長度為10～12 h。

2.2 誘導(dǎo)光周期下處理不同時間的成花反應(yīng)

由誘導(dǎo)光周期(光照/黑暗為10 h/14 h)處理了不同時間的植株，移到非誘導(dǎo)光周期(4 h暗中斷)中后，植株的成花存在著顯著的差異(表2)。從植株的成花上看，隨著誘導(dǎo)光周期處理的時間延長，成花植株的比率逐漸升高。當處理時間達到30 d以上時，處理的植株全部成花。從現(xiàn)蕾時間和始花時間上看，在誘導(dǎo)光周期下處理10 d以上的各處理中，均無顯著差異，說明小花一旦在誘導(dǎo)光周期下誘導(dǎo)啟動，其發(fā)育不受光周期處理時間長短的影響；從花序和花朵的形成上看，當誘導(dǎo)光周期處理10 d時，花序數(shù)和花朵數(shù)的平均值均小于其標準差，說明誘導(dǎo)光周期處理10 d，由于誘導(dǎo)的時間太短，植株間花序和花朵形成的數(shù)量差異較大。隨后，隨著誘導(dǎo)光周期的處理時間延長，花序數(shù)和花朵數(shù)均逐漸增多，并且在處理時間達到30 d以上的各處理間均無顯著差異，表明馥郁滇丁香‘香妃’的限界性誘導(dǎo)光周期為30 d短日照。另外，觀察發(fā)現(xiàn)，植株在誘導(dǎo)光周期下處理5～25 d后移入非誘導(dǎo)光周期中，部分頂芽會發(fā)生成花逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，即單個頂芽上簇生出多個具狹小葉片的營養(yǎng)芽(圖版Ⅰ，C)，或花序上的小花花蕾停止發(fā)育，苞片和萼片變綠，呈葉片狀(圖版Ⅰ，D)。

表1 不同光周期對馥郁滇丁香‘香妃’成花的影響

注：同一列中不同小寫字母表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P=0.05)。下同

Note: The data followed by different normal letters within the same column are significantly different at 0.05 level. The same as below

2.3 誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)光周期下花芽形態(tài)分化進程

2.3.1花序的形態(tài)特點馥郁滇丁香‘香妃’為傘房狀聚傘花序，頂生于枝上(圖版Ⅰ，E、F)?？偦ㄐ虻幕烤咭粚ι娜~狀總苞片，呈卵狀披針形?；ㄐ蚬５闹鬏S頂端具3朵小花，在主軸的兩側(cè)對生出次級花序梗或小花，在次級花序梗上又對生出下級花序?；蛐』?。在每級次級對生花序?；蛐』ɑ慷季咭粚ι娜~狀苞片，呈線形，3～4朵小花著生在小花序梗的頂部，并在花柄著生處具1對對生的葉狀線形苞片(圖版Ⅰ，E)。觀察發(fā)現(xiàn)，在同一單株上有的花序花朵數(shù)多，而有的花序花朵數(shù)少，造成這種差異的原因在于，花朵數(shù)較少的花序在其主軸兩側(cè)對生出的次級花序梗少，或者無次級花序梗，直接在花序主軸上著生小花；花朵數(shù)較多的花序在其主軸兩側(cè)則對生出許多的次級花序梗。

2.3.2花芽分化時期及特征花芽分化時期的劃分以花序中頂花各時期的原基出現(xiàn)為標準。根據(jù)觀察的結(jié)果，將馥郁滇丁香‘香妃’的花芽分化時期劃分為6個時期。

(1)未分化期：生長錐頂端狹小，呈尖圓錐形，分化的原基分生細胞體積較小，排列緊密，細胞質(zhì)濃。生長錐由其外周的分生組織不斷分化出的葉原基包圍(圖版Ⅰ，G)。

(2)總苞原基分化期：生長錐頂端的細胞群漸平漸寬地分裂，生長發(fā)育成半球形，此時期是營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的重要標志(圖版Ⅰ，H)。隨后，半球狀的生長錐不斷加寬生長，并在生長錐的兩側(cè)隆起形成2個突起，即總苞原基(圖版Ⅰ，I)。

(3)花序或小花原基分化期：總苞原基內(nèi)部的生長錐表面隆起形成3個半球形的突起，即次級花序原基或小花原基。同時，在苞片原基的外側(cè)基部分化出側(cè)花序原基(圖版Ⅰ，J)。3個半球形的花序原基繼續(xù)伸長和加寬生長并且相互分離，隨后，在每個花序原基的兩側(cè)突起分化出苞片原基。處于此時期的花序原基可有2個發(fā)育方向，一個是苞片原基內(nèi)的單個花序原基表面隆起形成3個次級的花序原基(圖版Ⅰ，K)；另一個是，苞片原基內(nèi)的單個花序原基逐漸加寬生長并變成頂端變平的小花原基(圖版Ⅰ，L)。從整個花序的發(fā)育進程來看，頂花序原基的發(fā)育早于側(cè)花序原基(圖版Ⅰ，J)。

(4)花被原基分化期：在小花原基頂部的平面周緣處隆起形成5個突起，即萼片原基。從縱切面上僅能觀察到2個萼片原基(圖版Ⅰ，M)，從花蕾上可明顯看到5個宿存的萼片(圖版Ⅰ，D)。緊隨萼片原基發(fā)生之后，在萼片原基內(nèi)側(cè)的基部逐漸隆起形成花瓣原基(圖版Ⅰ，N)。

表2 光照/黑暗為10 h/14 h的光周期誘導(dǎo)不同天數(shù)對馥郁滇丁香‘香妃’成花的影響

表3 誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)光周期下馥郁滇丁香芽的形態(tài)分化進程

注：隨機選10株植株，每株選1個主枝頂芽觀察

Note: Ten plants were randomly selected, one terminal bud of the main shoot from each plant was observed

(5)雄蕊原基分化期：在花瓣原基的內(nèi)側(cè)突起形成雄蕊原基。從縱切面僅能觀察到2個雄蕊原基(圖版Ⅰ，O)，而從發(fā)育完全的花朵上可觀察到5個花粉囊。

(6)雌蕊原基分化期：最初，在小花原基凹陷處的中央底部處隆起1個突起，即花柱原基(圖版Ⅰ，P)。隨后，在子房中央的胎座上出現(xiàn)一群分裂活躍的細胞群，即胚珠原基(圖版Ⅰ，Q)，胚珠原基進一步發(fā)育為成熟的胚珠(圖版Ⅰ，R)。

2.3.3誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)光周期下芽的形態(tài)分化進程觀察結(jié)果表明(表3)，在光照/黑暗為10 h/14 h的誘導(dǎo)光周期下，處理7 d，全部植株處于營養(yǎng)生長期；處理10 d，3/10的植株處于總苞原基分化期；處理30 d，全部植株處于花被原基形成期，從外形上可明顯觀察到芽體膨大呈圓錐形(圖版Ⅰ，B)，此形態(tài)為花芽分化的最初外觀表征；處理55 d，內(nèi)部形態(tài)全部處于花器官完整形成期，外形上處于花蕾尚未伸出萼片的現(xiàn)蕾期；處理86 d，全部植株達到花朵開放期；在4 h暗中斷的非誘導(dǎo)光周期下，全部植株的芽一直處于營養(yǎng)生長的未分化期(圖版Ⅰ，A、G)，甚至在其處理時間超出誘導(dǎo)光周期下始花時間2倍之后，仍處于營養(yǎng)芽狀態(tài)。以Damann等[17]的判斷標準，可再次證實馥郁滇丁香‘香妃’為質(zhì)性或?qū)Ｐ远倘照罩参铩?/p>

3 討 論

3.1 花序及花朵分化的特點

許多研究表明，花序型植物的花芽分化時期依次為總苞原基、花序原基、小花原基、萼片原基、花瓣原基、雄蕊原基、雌蕊原基7個時期，如山雞椒(Litseacubeba(Lour.)Pers.)[18]、桂花(Osmanthusfragrans)[12, 19-21]、金邊瑞香(Daphneodoravar.marginataMak.)[22]、‘地平線’天竺葵(Pelargoniumhortorum‘Horizon’)[16]等；單生花的花芽分化時期依次為苞片原基、萼片原基、花瓣原基、雄蕊原基、雌蕊原基6個時期，如杏李(Prunussalicina×armeniaca)[23]、單葉薔薇(Rosapersica)[24]、草原龍膽(Eustomagrandiflorum)[25]等。在本試驗中，馥郁滇丁香‘香妃’屬于花序型植物，其分化的規(guī)律與報道的花序型植物基本一致。值得一提的是，馥郁滇丁香‘香妃’的花序原基可分化成次級花序原基，也可分化成小花原基。然而，何種因素才能促使更多的次級花序原基分化，值得進一步研究，這對提高盆花花序的花朵數(shù)量具有重要的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。另外，在整個花序的發(fā)育過程中，雖然花序中央頂部的花序原基分化早于側(cè)花序原基，但是，整個花序中的花朵幾乎同時開放，因此，側(cè)花序的發(fā)育速度快于頂花序，這與‘厚瓣金桂’桂花的花序分化特點相似，保證了花序在開花時間上的同步性[21]。

3.2 光周期對成花效應(yīng)的影響

植物需經(jīng)過一定時期的營養(yǎng)生長后才能進入成花決定態(tài)，達到成花決定態(tài)的植物一旦在外界條件適宜的情況下就可啟動花的發(fā)生，進而開始花的發(fā)育過程[26]。然而，如果環(huán)境條件不適應(yīng)，植物可能從生殖生長又逆轉(zhuǎn)回營養(yǎng)生長[27]。對于光周期型植物而言，有利的光周期誘導(dǎo)成花，而不利的光周期抑制成花或使成花發(fā)生逆轉(zhuǎn)[28-29]。如Bougainvilleaxbuttiana‘Afterglow’品種開花的適宜日照長度為8～11 h，在長日照或短日照的暗期補光30 min能抑制其開花[30]。而在短日植物茼蒿(Chrysanthemummorifolium)中，短日照誘導(dǎo)15 d之后移入長日條件下，花序的中心花部位不形成花，而保持綠色，說明發(fā)生了逆轉(zhuǎn)；如果在苞葉已經(jīng)開始形成時移入長日條件下則無逆轉(zhuǎn)發(fā)生，說明在苞葉開始形成之前，成花決定發(fā)生不徹底導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)發(fā)生[31]。在本研究中，當短日照誘導(dǎo)周期數(shù)少于30 d時，移入長日條件下則會發(fā)生花序和花的逆轉(zhuǎn)，其中，花序逆轉(zhuǎn)由花序原基或次級花序原基逆轉(zhuǎn)成營養(yǎng)生長錐，而已分化出的苞片則逆轉(zhuǎn)成葉片。只有當短日照誘導(dǎo)周期數(shù)大于30 d時，花序和花的決定才能完成徹底，并且才不會發(fā)生成花逆轉(zhuǎn)。從花芽分化的進程可看出，短日照誘導(dǎo)30 d時，花芽外形呈膨大的圓錐形，然而，由于開花時間還受溫度等因素影響，因此，在生產(chǎn)中，不可采用短日照誘導(dǎo)周期數(shù)來作為判斷成花決定完成徹底的標準，而可采用該形態(tài)特征來作為判斷標準。

綜上所述，在馥郁滇丁香‘香妃’的花期調(diào)控中，在花芽尚未發(fā)育成膨大的圓錐形之前，一定要保證適宜的光周期連續(xù)誘導(dǎo)，直至花芽發(fā)育成膨大的圓錐形，否則，花序和花的逆轉(zhuǎn)會降低盆花的成花效應(yīng)。

圖版Ⅰ 馥郁滇丁香‘香妃’的花芽分化形態(tài)特征
A～F.芽和花序不同發(fā)育時期的外部形態(tài)特征:A.營養(yǎng)芽；B.分化的芽；C～D.成花逆轉(zhuǎn)；E～F.傘房狀聚傘花序。BR.苞片。G～R.花芽分化不同時期的內(nèi)部形態(tài)特征:G.未分化期，×100；H～I.總苞原基分化期，×200；J～K.花序原基分化期，×100，×200；L.小花原基分化期，×200；M～N.花被原基分化期，×200；O.雄蕊原基分化期，×200；P～R.雌蕊原基分化期，×200，×100，×100。
V.生長錐；LE.葉原基； BR.苞片原基；IN.花序原基；SI.側(cè)花序原基；SF.小花原基；SE.花萼原基；PE.花瓣原基；ST.雄蕊原基；PI.雌蕊原基；OV.胚珠原基；PL.胎座。
Plate Ⅰ Morphology characteristics of flower bud differentiation in L. gratissima ‘Xiangfei’
A-F. The appearance characteristics in different phases of bud and inflorescence: A. Vegetative bud; B. Differentiated bud; C-D. Floral reversion; E-F. Corymbose cyme. BR. Bract.
G-R. The internal morphology characteristics in different phases of flower bud differentiation: G.Undifferentiation phase,×100; H-I. Bract primordium differentiation phase, ×200; J-K. Inflorescence primordium differentiation phase, ×100,×200; L. Small floral primordium differentiation phase, ×200; M-N. Perianth primordium differentiation phase,×200; O. Stamen primordium differentiation phase, ×200; P-R. Pistil primordium differentiation phase, ×200, ×100, ×100.
V. Vegetation cone; LE. Leaf primordium; BR. Bract primordium; IN. Inflorescence primordium; SI. Side inflorescence primordium; SF. Small floral primordium; SE. Sepal primordium; PE. Petal primordium; ST. Stamen primordium; PI. Pistil primordium; OV. Ovule primordium; PL. Placenta.