RM6240型系統(tǒng)在記錄誘發(fā)場突觸后電位中的應用

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(山東師范大學 生命科學學院, 山東 濟南 250014)

神經系統(tǒng)信息傳遞的基本形式是電信號，突觸后電位就是其中的一種。大量排列整齊的神經纖維形成的突觸后電位，整合為場突觸后電位。場突觸后電位能夠很好地衡量突觸傳遞強度，是評價突觸傳遞效能的重要指標，也為研究突觸可塑性的分子機制提供了有效手段。20世紀50年代，研究者就開始應用電刺激方法在海馬復合體中記錄誘發(fā)突觸后場電位，從而為研究海馬依賴的學習記憶的分子機制開辟了新途徑[1]。隨后，研究者將誘發(fā)場突觸后電位記錄技術運用到有纖維連接的不同腦區(qū)，如內側前額葉和伏隔核2個腦區(qū)。組織解剖學研究表明,內側前額葉有大量谷氨酸能神經纖維投射至伏隔核，這些神經投射纖維在伏隔核背部(側腦室底端)相對集中且排列整齊，因此通過電刺激內側前額葉，可以在伏隔核誘發(fā)場突觸后電位[2-4]。由于該通路在目標導向行為以及動機行為中扮演重要角色，因此，研究該通路所發(fā)生的神經適應性改變對揭示目標導向或動機行為內在神經機制具有重要價值[5-7]。

RM6240生物信號記錄系統(tǒng)是集放大器、濾波器、模數(shù)(A/D)轉換以及刺激隔離器一體的電信號記錄分析系統(tǒng)。該系統(tǒng)采樣頻率最高可達400 kHz，通常記錄場電位所采用的采樣頻率為1～2 kHz。同時，該系統(tǒng)的低通濾波截止頻率可高達10 kHz，而高通濾波頻率可以為直流(0 Hz)或截止頻率低達0.016 Hz；電位響應靈敏度最大為2 μV/div。此外，刺激隔離器可以產生各種單脈沖、雙脈沖以及連續(xù)單脈沖刺激，且可以在電流或電壓模式切換，刺激選擇比較靈活。由此可見，RM6240型系統(tǒng)具備開展誘發(fā)場電位實驗的條件。

盡管RM6240型生物信號記錄系統(tǒng)被廣泛用于大學生理學教學實驗中，但是大部分院校并沒有面向學生開展誘發(fā)場電位實驗，其主要原因是基于該系統(tǒng)的誘發(fā)場電位實驗操作平臺未被搭建。本文中應用RM6240型系統(tǒng)，并結合自制電極，嘗試記錄內側前額葉-伏隔核通路中誘發(fā)場突觸后電位；同時，探索合適的方法以完善實驗數(shù)據(jù)分析，為學生開展相關實驗提供相應的參考。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑包括：鎳鉻合金絲，美國California Fine Wire公司；水合氯醛，天津科密歐化學試劑有限公司；異氟烷，深圳瑞沃德生命科技有限公司；尼氏染色液，上海碧云天生物技術有限公司。

主要儀器包括：RM6240C型系統(tǒng)和SWF-1D型微電極放大器，成都儀器廠；Cryostar NX 50型冰凍切片機，美國Thermo Fisher Scientific公司；SMZ745T型解剖鏡成像系統(tǒng)， 日本Nikon公司； MATLAB軟件， 美國MathWorks公司； pClamp10軟件， 美國Molecular Devices公司。

1.2 實驗動物

健康成年雄性Wistar大鼠， 體質量為250～310 g，購于山東大學實驗動物中心，許可證SCXK(魯2013-0009)。動物飼養(yǎng)于恒定溫度為(23±1)℃及相對濕度為50%～60%的飼養(yǎng)房中，可以自由取食和飲水。動物在飼養(yǎng)房中適應1周后，開始被用于實驗。

1.3 電極

電極材質為特氟龍包被的鎳鉻合金絲，直徑為100 μm。首先，剪裁適當長度的合金絲(長度取決于目標腦區(qū))若干，將合金絲一端特氟龍包被層剝離(長度約為2 mm)，焊接于排母座上，將2股合金絲均勻地纏繞在一起。然后，修剪(傾斜45°)以保證2股合金絲尖端有一定高度差(0.5～1 mm)。最后，基座和合金絲連接處用絕緣膠密封，以保證電極阻抗為0.5～0.8 MΩ，放置備用。

1.4 誘發(fā)場電位記錄及數(shù)據(jù)分析

本研究中采用腦立體定位儀以精確定位內側前額葉和伏隔核。內側前額葉屬于皮質，位于顱骨下淺層，定位相對容易，但是伏隔核屬于皮質下深部核團，定位較難。另外，2個腦區(qū)解剖位置較近，前后相差約2.2 mm，因此，本實驗中對伏隔核定位的操作臂向尾部方向傾斜10°，以便對內側前額葉定位的操作臂進行操作。

稱取大鼠體質量，按照400 mg/kg的劑量，向其腹腔注射質量分數(shù)為4%的水合氯醛進行誘導麻醉(僅用于手術)。待大鼠呼吸均勻平緩，且對后肢疼痛刺激無收縮反射后，將其固定于立體定位儀上，調整兩側耳桿使大鼠頭部正中線位于齒桿中央，固定耳桿和齒桿，確保大鼠顱骨平面水平。去除皮下結締組織以暴露顱骨，用少量體積分數(shù)為2%的雙氧水清洗顱骨表面， 以使顱骨矢狀縫及冠狀縫更加清晰， 便于精確定位。 以前囟作為參照點， 對參照點進行標記并記錄其對應坐標， 依據(jù)大鼠腦立體定位圖譜[8]以及經驗確定內側前額葉及伏隔核2個腦區(qū)的坐標并進行標記。 內側前額葉坐標如下： 前囟前3 mm，矢狀縫旁開0.7 mm， 顱骨表面下4 mm。伏隔核坐標如下：前囟前0.8 mm，矢狀縫旁開1.2 mm，顱骨表面下6～7 mm。標記完畢后，用微型顱骨鉆在標記點處鉆孔以暴露腦區(qū)。同時，打開RM6240型系統(tǒng)以及SWF-1D微電極放大器， 調整軟件控制界面， 以便觀察電信號。 將固定于操作臂上的刺激電極緩慢植入內側前額葉， 接著將記錄電極緩慢植入到伏隔核， 在植入電極的同時觀察信號，待誘發(fā)場電位出現(xiàn)時， 停止電極植入。 需要注意的是， 由于大鼠個體差異， 因此電極植入的實際深度和預設深度有一定有出入。

確定信號后，異氟烷被用來維持大鼠麻醉，待麻醉穩(wěn)定后，開始采集信號。信號經過0.8～100 Hz帶通濾波后，采用10 kHz采樣頻率采集數(shù)據(jù)，電位響應敏感度為1 mV/div。待信號穩(wěn)定后，開始實驗。首先，測量刺激電流與場電位幅度反應曲線。其次，根據(jù)反應曲線，調整場電位幅度保持在最大幅度40%～50%的刺激電流作為基線刺激，開始持續(xù)記錄場電位信號(每30 s刺激一次)至少1 h。最后，場電位信號數(shù)據(jù)通過MATLAB以及pClamp10軟件離線分析，并對數(shù)據(jù)進行歸一化處理。需要注意的是，在信號采集過程中確保動物體溫穩(wěn)定。

1.5 組織學觀察

實驗結束后， 首先對腦區(qū)進行電損毀， 電流強度為0.2 mA， 持續(xù)時間為10 s。 然后進行灌流，灌注約250 mL生理鹽水后， 再緩慢灌注250 mL質量分數(shù)為4%的甲醛溶液。 繼而取出腦組織置于質量分數(shù)為4%的甲醛溶液中后固定48 h， 再轉入質量分數(shù)為30%蔗糖溶液進行脫水48～96 h， 并保存在冰箱(4 ℃)里以待冰凍切片。 利用冰凍切片機進行連續(xù)冠狀切片(厚度為30 μm)， 將包含內側前額葉和伏隔核腦區(qū)的腦片貼片， 風干后利用尼氏染色液進行染色， 腦片經一系列脫水和透明處理后迅速用中性樹膠封片。 用SMZ745T型解剖鏡成像系統(tǒng)觀察記錄電極與刺激電極尖端位置， 并拍照。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計學軟件SPSS16.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均值±標準誤差。應用重復方差檢驗分析信號隨時間變化的顯著性，顯著性水平P<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 在體記錄方法

利用自制電極進行在體誘發(fā)場突觸后電位記錄的方法見圖1。圖1(a)所示為2股鎳鉻合金絲，被用來作為刺激電極和記錄電極；需要注意的是，電極與基座封閉要嚴密，不然電信號易受到干擾，引入噪音。圖1(b)所示為在刺激電極未刺激之前記錄的基底噪音，平均電壓為-20～20 μV，基底噪音較理想。圖1(c)所示為刺激電極和記錄電極在相應腦區(qū)位置的示意圖，如方法中所述，記錄電極向動物尾部方向傾斜10°；需要注意的是，在開顱時避免腦組織出血，另外，內側前額葉靠近矢狀縫，需要精確定位以防止破壞矢狀縫下血管。圖1(d)所示為場電位代表波形(10個連續(xù)記錄的波形疊加)，2條虛線之間的垂直距離被測量為電壓幅度，即刺激偽跡(圖中正峰值)前3 ms窗口內電壓平均值與負峰值左右2 ms窗口內電壓平均值之間的差值。RM6240系統(tǒng)自帶軟件并不能滿足本研究的數(shù)據(jù)分析需求，因此，本文中建立了基于pClamp10信號分析軟件的數(shù)據(jù)分析方法。利用MATLAB軟件將RM6240系統(tǒng)生成的數(shù)據(jù)文本文件轉變?yōu)閜Clamp10軟件可讀的文本文件，隨后將數(shù)據(jù)導入pClamp10軟件，應用其強大的波形數(shù)據(jù)分析功能對場電位幅度值進行批量分析及輸出。

2.2 場電位信號

內側前額葉-伏隔核通路中誘發(fā)場突觸后電位見圖2。 圖2(a)所示為代表性刺激電流-場電位反應曲線， 圖中灰色點幅度值對應于內圖中場電位波形， 刺激電流依次為0.4、 0.7、 0.8、 1.8、 2.0 mA； 場電位隨著刺激電流的增大而增加， 在刺激電流為1.8 mA時達到飽和。 圖2(b)所示為代表性場電位隨時間的變化(60 min)， 每個數(shù)據(jù)點代表5個連續(xù)記錄波形的疊加， 信號保持相對穩(wěn)定。 圖2(c)所示為重復方差分析結果，P=0.25顯示場電位隨時間并無顯著性變化， 表明該記錄系統(tǒng)平臺至少可以穩(wěn)定記錄信號1 h。 圖2(d)所示為代表性組織檢測圖， 在記錄過程中要保持麻醉水平及動物體溫穩(wěn)定， 若二者發(fā)生變化，可引起信號的變化。

3 討論

本文中主要針對RM6240生物信號記錄系統(tǒng)在記錄誘發(fā)場突觸后電位中的應用，對RM6240系統(tǒng)中場電位信號數(shù)據(jù)分析方法進行了改進。研究結果顯示，RM6240系統(tǒng)可以記錄到內側前額葉-伏隔核通路中誘發(fā)場突觸后電位，且信號至少能夠穩(wěn)定地維持1 h。

本研究中應用的電極是鎳鉻合金絲電極，除了這種材質的電極外，玻璃電極、鉑銥合金絲電極以及鎢絲電極也常被用于電生理研究[9-11]。這些材質的電極具有很好的組織(如腦組織)親和性，不易引起組織炎癥反應。一般來講，玻璃電極易破碎，通常被用于麻醉狀態(tài)下的急性實驗，而金屬電極則可以被埋植在動物腦組織內，適合于清醒自由活動時的長期或慢性實驗[12-13]。另外，玻璃電極制作需要特定的設備儀器，而金屬絲電極制作相對簡單。在具體應用時應依據(jù)實驗目的及實驗條件選擇合適的電極材料。

RM6240系統(tǒng)相比于國外的同類電生理儀器設備價格便宜，已在大學電生理教學實驗中廣泛應用，且方便搭建場電位記錄平臺，但是，該平臺仍然存在一些不足。1)該系統(tǒng)抗干擾能力差，需要放置在屏蔽箱中，限制了該系統(tǒng)應用于清醒自由活動條件下誘發(fā)場電位的記錄，尤其是與動物行為的同步記錄。2)為了適應本實驗程序要求，需要用到同步觸發(fā)功能，但是RM6240型系統(tǒng)對每一次刺激產生的場電位信號儲存為獨立子文件，為數(shù)據(jù)的批量分析帶來了挑戰(zhàn)。3)該系統(tǒng)本身的數(shù)據(jù)分析功能不完善，場電位幅值測量不夠靈活。鑒于后2點，本文中探索了用MATLAB批量處理由該系統(tǒng)導出的所有子文件(格式為文本文件.txt)，然后應用pClamp10軟件進行數(shù)據(jù)分析。結果表明，該方法具有可行性，進而為后續(xù)實驗數(shù)據(jù)分析奠定了基礎。

如前言所述，內側前額葉投射大量谷氨酸能纖維至伏隔核。Moussawi等[3]研究表明，刺激內側前額葉時在伏隔核內記錄的場電位是谷氨酸介導的興奮性突觸后電位，因此，通過記錄內側前額葉-伏隔核場突觸后場電位，可以探測2個腦區(qū)間谷氨酸能突觸傳遞的狀態(tài)。另外，根據(jù)研究目的以及涉及的動物行為模型，比如研究情緒相關的學習記憶，該平臺可以被用來記錄基底外側杏仁核-伏隔核通路中誘發(fā)場突觸后電位，從而在環(huán)路水平上探究情緒相關學習記憶的內在神經機制[14-16]。

4 結語

綜上所述，本文中應用RM6240生物信號記錄系統(tǒng)以及自制的鎳鉻合金絲電極，記錄了內側前額葉-伏隔核場突觸后場電位，信號至少能夠穩(wěn)定地維持1 h。另外，結合MATLAB和pClamp10軟件有效地解決了RM6240系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析的局限性，為后續(xù)實驗建立了完善的數(shù)據(jù)分析框架。最后，盡管此平臺操作相對難度較大，但是能夠為本科生應用RM6240系統(tǒng)開展誘發(fā)場電位實驗提供參考，可用于提高學生實驗操作技能以及創(chuàng)造性思維能力。

致謝：非常感謝艾洪濱教授在撰稿過程中給予的指導和建議。