CleistanthinA對(duì)黑素瘤細(xì)胞遷移及β—catenin蛋白的影響

潘盛 高騰 李蒙

【摘 要】

目的：研究Cleistanthin A（CA）對(duì)黑素瘤細(xì)胞遷移及β-catenin蛋白的影響。方法：通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)觀察CA對(duì)A375細(xì)胞遷移活性的影響；通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)觀察CA對(duì)A375細(xì)胞中β-catenin蛋白的影響。結(jié)果：劃痕實(shí)驗(yàn)顯示：CA對(duì)A375細(xì)胞的遷移有抑制作用，且有劑量依賴性，且0.1μM這個(gè)濃度接近半數(shù)遷移抑制率；結(jié)合我們前期的實(shí)驗(yàn)得知：CA對(duì)A375細(xì)胞的生長(zhǎng)活性有抑制作用，且有劑量依賴性，但低濃度的CA對(duì)A375細(xì)胞的活性抑制作用與陰性對(duì)照組相比雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義卻不顯著[1]，因此選用0.03μM、0.1μM、0.3μM較低濃度組CA進(jìn)行后面的實(shí)驗(yàn)，以降低細(xì)胞凋亡對(duì)遷移的影響。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示：CA對(duì)A375細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)有抑制作用，且有劑量依賴性，0.3μM濃度時(shí)與陰性對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 CA可抑制A375細(xì)胞的生長(zhǎng)活性及遷移且可下調(diào)與生長(zhǎng)及遷移密切相關(guān)的β-catenin蛋白的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 CleistanthinA，惡性黑素瘤，遷移，β-catenin

【中圖分類號(hào)】R715 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】

B 【文章編號(hào)】1005-0019（2018）16-230-01

Affect of Cleistanthin A on the migration and β-catenin in melanoma cell of A375

Pansheng，gaoteng，limeng

The skin Department，The Seventh People's Hospital ， Changzhou Jiangsu，213003

Abstract Objective：to investigate the effect of Cleistanthin A（CA）treatment on melanoma cell migration and β-catenin. Methods The inhibitory activities of CA on cultured A375 cell migration were detected by Wound-healing assay；Western blot were used to detect the activity of β-catenin. Results Wound-healing assay shows：CA has obvious inhibitory effect to A375 cell migration activity， and in a dose dependent manner， and the concentration of 0.1μM is near the median inhibition rate. Combined with our previous experiments， we learned that： Cell viability is affected significantly by CA. It appears in a dosage manner. But the viability of A375 is not obviously affected by CA in low concentration， So the concentrations of 0.03μM， 0.1μM and 0.3μM of CA are used for further study， in order to reduce the effect of apoptosis on migration. Western blot shows： CA can inhibit the growth activity and migration of A375 cells and down-regulate the expression of beta-catenin protein which is closely related to growth and migration.

Key words：CleistanthinA；melanoma；migration；β-catenin

Cleistanthin A （CA），一種山荷葉素天然糖苷，被證實(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞的空泡型H+-ATPase （V-ATPase）的活性有抑制作用，且中和溶酶體的pH值在納摩爾濃度[2]。關(guān)于CA是否能影響黑素瘤細(xì)胞A375的PH值我們進(jìn)行了一些前期實(shí)驗(yàn)，并且證實(shí)CA可特異性抑制A375細(xì)胞的V-ATPase活性，降低細(xì)胞質(zhì)PH、堿化溶酶體酸性，并且抑制A375細(xì)胞侵襲及遷移活性[1]。目前Wnt/β-catenin是一條公認(rèn)與腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、遷移、凋亡等生物學(xué)密切相關(guān)[3，4]。并且有實(shí)驗(yàn)證實(shí)下調(diào)β-catenin表達(dá)能使人黑色素細(xì)胞瘤A375細(xì)胞增殖變緩，細(xì)胞侵襲、遷移能力下調(diào)[5]。因此，我們可以大膽假設(shè)Cleistanthin A （CA）是否通過(guò)這條通路影響人黑色素細(xì)胞瘤A375細(xì)胞侵襲及遷移，基于這個(gè)假設(shè)本研究通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cleistanthin A（CA）對(duì)β-catenin的影響，從而為其機(jī)制的研究做好鋪墊。

1 材料與方法

RPMI-1640和小牛血清（FBS）獲自Gibco（Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA）。青霉素和鏈霉素從Thermo Fisher Scientific，Inc.獲得。Cleistanthin A（CA）由南通大學(xué)航海醫(yī)學(xué)研究所（中國(guó)南通）合成。巴弗洛霉素A1來(lái)自于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。CA和巴弗洛霉素A1溶于二甲基亞砜（DMSO）中，在-4℃保存直至分析。

A375人黑素瘤細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所（中國(guó)北京）友情提供。 在整個(gè)研究中，將細(xì)胞在補(bǔ)充有10%FBS和抗生素（100U / ml青霉素和100μg/ ml鏈霉素）的RPMI-1640中37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為含5%CO2的潮濕空氣。

1.1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定。 體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定用于觀察CA處理后A375細(xì)胞的遷移。 將細(xì)胞（1×106個(gè)細(xì)胞/ ml）接種到6孔板中并孵育24小時(shí)。然后用無(wú)菌微量移液管尖端刮下細(xì)胞單層的中心，以產(chǎn)生恒定寬度的直線間隙。用PBS洗滌孔，并將細(xì)胞接種于各種濃度的CA（0，0.003，0.01，0.03，0.1和0.3μM）。 使用倒置光學(xué)顯微鏡（放大倍數(shù)，×200）（Leica Microsystems GmbH，Wetzlar，Germany）在0和24小時(shí)對(duì)劃痕閉合進(jìn)行成像、測(cè)量并統(tǒng)計(jì)。

1.2 western blot實(shí)驗(yàn)測(cè)定。將細(xì)胞接種到6cm培養(yǎng)皿中，24小時(shí)后達(dá)到60-80%融合。加入各種濃度（0，0.03，0.1和0.3μM）和巴弗洛霉素A1（0.1μM）的CA。在24小時(shí)，使用含有0.01%蛋白酶抑制劑混合物（Thermo Fisher Scientific，Inc.）的裂解緩沖液（碧云天生物技術(shù)研究所）收集總細(xì)胞裂解物，并用超聲處理器處理。將細(xì)胞裂解物在4℃，10000r/min，轉(zhuǎn)速離心10分鐘并收集上清液。用BCA法測(cè)定總細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜在5%脫脂乳中在室溫下封閉1小時(shí)。隨后將封閉好的PVDF膜放入 1：1000 配置好的一抗溶液中4℃過(guò)夜，β-catenin 及內(nèi)參β-actin 分開(kāi)孵育。TBST清洗3遍，每遍 10min。之后再將PVDF膜放入1：2500配置好的羊抗兔、羊抗鼠 Ig G二抗中室溫下孵育1h。TBST清洗3遍，每遍 10min。在暗室中，將現(xiàn)配好的發(fā)光液滴加于 PVDF膜之上，用Odyssey CLX Infrared Imaging System掃描PVDF膜，保存熒光條帶圖。Image J軟件分析條帶以明確不同細(xì)胞中β-catenin 蛋白表達(dá)差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 每樣本進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。采用Graphpad Prism 5.0 （Graphpad Software.Inc，San Diego，CA，USA） 統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（means ± S.D.）表示。進(jìn)行單因素方差分析時(shí)，顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 CA對(duì)A375細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及抑制遷移的藥物濃度的確定

我們通過(guò)之前的實(shí)驗(yàn)得知：CA對(duì)A375細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性有劑量依賴性，雖與陰性對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但都未達(dá)到IC50值。通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)探索性地檢測(cè)CA對(duì)A375細(xì)胞的遷移活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CA處理A375細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞劃痕愈合率隨藥物濃度的增高明顯下降，當(dāng)藥物濃度為0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM時(shí)細(xì)胞劃痕愈合率與陰性對(duì)照相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），CA濃度為0.1μM時(shí)接近半數(shù)遷移抑制率。根據(jù)以上結(jié)果我們選擇0.03μM、0.1μM、0.3μM這三個(gè)濃度為實(shí)驗(yàn)濃度組。

2.2 CA對(duì)A375細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)水平的影響

培養(yǎng)A375細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度的CA（0.03μM、0.1μM、0.3μM）以及陽(yáng)性對(duì)照藥Bafilomycin A1（0.1μM）處理24 h后，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)（圖2）隨著藥物濃度的增加，β-catenin的蛋白表達(dá)降低。當(dāng)濃度為0.3μM時(shí)，與陰性對(duì)照組相比即可出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；相同濃度下與Bafilomycin A1相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

惡性黑素瘤是皮膚癌中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，惡性程度較高且有年輕化趨勢(shì)。同時(shí)它是一個(gè)容易侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的腫瘤。目前治療方法居多，包括手術(shù)、放療、化療及生物治療等，但對(duì)于它的遠(yuǎn)期生存率的控制仍然比較局限。因此，尋求一個(gè)新的治療方法有著重要的意義。

CA，作為一種山荷葉素天然糖苷，在對(duì)抗MCF-7， HeLa， HepG2， HCT-116， U251 腫瘤細(xì)胞株中展現(xiàn)出了強(qiáng)大的抗腫瘤增殖作用[6]。且我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)CA作為一種新型的V-ATPase酶抑制劑，可以降低黑素瘤A375細(xì)胞V-ATPase酶的活性，抑制細(xì)胞內(nèi)的H+向細(xì)胞外轉(zhuǎn)移，從而降低細(xì)胞質(zhì)的PH，升高細(xì)胞外的PH，通過(guò)這種改變細(xì)胞微環(huán)境影響A375細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。

近年來(lái)，生物信號(hào)通路在惡性腫瘤的研究中是一個(gè)熱點(diǎn)，可能能揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。近年來(lái)，Vaid Mudit[7]等研究發(fā)現(xiàn)，活化β-catenin能促進(jìn)惡性黑色素瘤細(xì)胞的遷移、侵襲，并用β-catenin抑制劑 FH535作用于惡性黑色素瘤，發(fā)現(xiàn)FH535能抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞遷移、侵襲。為了探索CA對(duì)A375細(xì)胞侵襲及遷移的影響是否與這條通路有關(guān)，本研究通過(guò)western blot法得出經(jīng)過(guò)CA處理的A375細(xì)胞中的β-catenin蛋白的表達(dá)有劑量依賴性，且在0.3μM濃度時(shí)與陰性對(duì)照組相比抑制作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從而為CA抑制A375細(xì)胞遷移的機(jī)制研究奠定了一個(gè)理論的基礎(chǔ)。

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