尿液miRNA143和miRNA133a在膀胱癌診斷中的應(yīng)用

陸 陽(yáng)，梁 偉，宋永勝

（1.本溪市中心醫(yī)院泌尿外科，遼寧 本溪 117000；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院泌尿外科，遼寧 沈陽(yáng) 110004）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)高發(fā)腫瘤，死亡率居泌尿系統(tǒng)腫瘤的第2位。膀胱癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是膀胱鏡檢查及組織病理活檢。早期診斷及治療可以提高膀胱癌患者的存活率，改善患者生活質(zhì)量。膀胱鏡檢查為有創(chuàng)性檢查，疼痛、血尿等并發(fā)癥導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受限。目前，已有研究證明微小RNA（microRNA，miRNA）在腫瘤患者中表達(dá)異常[1-2]。泌尿系統(tǒng)腫瘤與miRNA關(guān)系的研究已表明其參與腫瘤的進(jìn)展[3-4]。因此，本研究擬探討尿液miRNA143和miRNA133a相對(duì)表達(dá)量在膀胱癌診斷中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年1月—2016年12月本溪市中心醫(yī)院膀胱癌患者（膀胱癌組）50例，其中男28例、女22例，年齡36～78歲，所有患者均行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切手術(shù)或膀胱全切手術(shù)，術(shù)后病理確診為膀胱癌。采用1974年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（the International Union Against Cancer，UICC）年會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[4]對(duì)50例膀胱癌患者進(jìn)行TNM分期，其中T1期25例、T2期20例和T3期5例。膀胱癌患者術(shù)前未行放化療，術(shù)前檢查無(wú)其他系統(tǒng)腫瘤。選取同期本溪市中心醫(yī)院泌尿系非腫瘤疾病患者（疾病對(duì)照組）50例，其中男24例、女26例，年齡39～80歲，包括尿路感染15例、尿路結(jié)石15例、前列腺增生癥20例。選取同期本溪市中心醫(yī)院體檢健康者50名作為正常對(duì)照組，其中男25名、女25名，年齡35～75歲。3組之間年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究獲本溪市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 收集膀胱癌組術(shù)前及術(shù)后3個(gè)月、疾病對(duì)照組、正常對(duì)照組晨尿50 mL。尿液標(biāo)本收集后30 min內(nèi)4℃ 3 000×g離心10 min，分離尿沉渣和上清。尿上清移至Eppendorf 管內(nèi)，按照mirVana PARIS試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）說(shuō)明書(shū)要求提取RNA，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。A260nm/A280nm比值的范圍為1.88～2.00。提取物使用前置-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄與聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)promega公司）對(duì)提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件：37 ℃ 60 min；65 ℃ 5 s。PCR反應(yīng)體系： 5 μL cDNA，5 μL SYBR green MIX（日本Takara公司），靶基因上、下游引物各1 μL，去RNA水3 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s；共40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)儀器為Prism 7500熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。PCR引物由大連寶生物工程有限公司合成，U6 F：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAT-3'；U6 R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；miRNA143 F：5'-TAGCATGAGGCGTTAGCATTTC-3'；miRNA143 R：5'-TCACTGCAACCTCCTCCTCC-3'；miRNA133a F：5'-TCATATTTGGTCCCCTTCAACC-3'；miRNA133a R：5'-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTCAC-3'。

對(duì)每個(gè)檢測(cè)目標(biāo)設(shè)定相同的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）基線和截點(diǎn)。每份標(biāo)本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。以內(nèi)參U6為miRNA相對(duì)定量參照。計(jì)算每個(gè)標(biāo)本所有Ct值的均值作為實(shí)際標(biāo)本的Ct值，減去U6 Ct值的均值為ΔCt，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量（2－ΔΔCt）來(lái)比較組間變化倍數(shù)[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)價(jià)尿液miRNA143和miRNA133a診斷膀胱癌的價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組、疾病對(duì)照組及正常對(duì)照組miRNA143、miRNA133a相對(duì)表達(dá)量的比較

膀胱癌組術(shù)前尿液miRNA143和miRNA133a的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于疾病對(duì)照組及正常對(duì)照組（P＜0.05），而疾病對(duì)照組與正常對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。膀胱癌組術(shù)后尿液miRNA143和miRNA133a的相對(duì)表達(dá)量明顯高于術(shù)前（P＜0.05），與疾病對(duì)照組及正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 膀胱癌組術(shù)前、術(shù)后及疾病對(duì)照組、正常對(duì)照組尿液miRNA143、miRNA133a相對(duì)表達(dá)量的比較[M（P25～P75）]

2.2 膀胱癌患者不同TNM分期之間尿液miRNA143及miRNA133a相對(duì)表達(dá)量的比較

膀胱癌患者不同TNM分期之間尿液miRNA143及miRNA133a的相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 膀胱癌患者不同TNM分期之間尿液miRNA143、miRNA133a相對(duì)表達(dá)量的比較 [M（P25～P75）]

2.3 尿液miRNA143和miRNA133a診斷膀胱癌的價(jià)值

ROC曲線分析顯示，術(shù)前尿液miRNA143相對(duì)表達(dá)量診斷膀胱癌的最佳臨界值為 ≤0.165，曲線下面積（area under curve，AUC）為0.827，敏感性為72.7%、特異性為80.8%。術(shù)前尿液miRNA133a相對(duì)表達(dá)量診斷膀胱癌的最佳臨界值為≤0.165，AUC為0.846，敏感性為75.0%、特異性為85.4%；二者聯(lián)合檢測(cè)的診斷性能無(wú)顯著提高。見(jiàn)表3、圖1。

表3 尿液miRNA143和miRNA133a診斷膀胱癌的ROC曲線參數(shù)

圖1 尿液miRNA143及miRNA133a診斷膀胱癌的ROC曲線

3 討論

膀胱癌的診斷依賴于膀胱鏡檢查與組織病理檢查的結(jié)合。然而，膀胱鏡檢查是有創(chuàng)性檢查，且價(jià)格較貴，給患者帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。膀胱癌的腫瘤標(biāo)志物目前有多種，如膀胱腫瘤抗原、纖維連接蛋白等，這些指標(biāo)均具有一定的敏感性和特異性，但都無(wú)法替代膀胱鏡檢查。尿液沉渣細(xì)胞RNA主要來(lái)源于腫瘤細(xì)胞、壞死或凋亡細(xì)胞、非細(xì)胞源等，易受到其他疾病的影響；尿液上清RNA則來(lái)源于細(xì)胞表面擠出的囊泡和循環(huán)中的miRNA，成分比較穩(wěn)定，受其他干擾因素影響小[5-6]。WANG等[7]、SNOWDON等[8]通過(guò)對(duì)尿液上清及尿液沉渣DNA的比較發(fā)現(xiàn)，尿液上清DNA的敏感性和特異性更高。由于尿液miRNA穩(wěn)定性較好，標(biāo)本也易獲得，因此可作為新的泌尿系統(tǒng)腫瘤的檢測(cè)指標(biāo)[9]。

miRNA143可以直接作用于腫瘤基因，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和復(fù)發(fā)，在前列腺、肺、胃腸道系統(tǒng)等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量明顯下調(diào)[5]。miRNA133a在膀胱癌、乳腺癌、頭頸部鱗癌、胃腸道惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量明顯下調(diào)，故可看作是一種抑癌基因。miRNA133a通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因CD47和EGFR等來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)[6]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌患者術(shù)前尿液miRNA143和miRNA133a相對(duì)表達(dá)量均明顯低于疾病對(duì)照組和正常對(duì)照組（P＜0.05）；腫瘤切除術(shù)后尿液miRNA143和miRNA133a的相對(duì)表達(dá)量均明顯升高；膀胱癌患者尿液miRNA143及miRNA133a的相對(duì)表達(dá)量與腫瘤TNM分期無(wú)關(guān)。ROC曲線分析顯示，術(shù)前尿液miRNA143、miRNA133a相對(duì)表達(dá)量診斷膀胱癌的最佳臨界值均為≤0.165，敏感性分別為72.7%、75.0%，特異性分別為80.8%、85.4%。

綜上所述，尿液miRNA143及miRNA133a的相對(duì)表達(dá)量可作為膀胱癌診斷和監(jiān)測(cè)的輔助指標(biāo)。由于本研究的樣本量較少，因此要將尿液miRNA143及miRNA133a作為膀胱癌輔助診斷和療效評(píng)價(jià)的無(wú)創(chuàng)性指標(biāo)仍需加大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。