干化學法檢測尿蛋白的影響因素分析

張 俊， 周芳芳， 徐 瑋， 王 蕾

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海 200232；2.上海市第八人民醫(yī)院，上海 200233；3.上海交通大學醫(yī)學院檢驗系，上海 200025）

近年來，慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）在全球范圍的發(fā)病率呈迅速增長趨勢，國內外文獻顯示CKD患者數(shù)已占到人口總數(shù)的4.3%～7.0%[1-3]，其中有58.7%～89.7%的CKD患者是通過篩查發(fā)現(xiàn)的。尿蛋白是臨床用于CKD篩查、診斷及治療監(jiān)測的重要指標。目前常用的篩查方法為尿干化學法，該法操作簡單，可快速獲得結果，但干擾因素較多。本研究針對尿蛋白干化學法檢測的干擾因素設計模擬實驗進行分析，評估尿蛋白干化學法出現(xiàn)假陽性或假陰性的原因。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2011年12月—2012年5月上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院門診及住院患者新鮮隨機尿液標本2 500份（門診患者標本1 300份，住院患者標本1 200份），及時檢測，同時查閱并記錄患者相關病史信息。

1.2 方法

1.2.1 尿蛋白定性檢測 （1）尿干化學法：H-800全自動尿液分析儀（長春迪瑞公司）及配套試紙條。（2）磺基水楊酸法：在尿液標本中分別滴加1～2滴200 g/L磺基水楊酸溶液（安徽弘慈公司），肉眼觀察結果，結果判定標準參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第3版）。

1.2.2 尿蛋白定量檢測 當2種定性檢測方法測定結果不一致時，采用比色法定量檢測尿蛋白，將定量檢測結果作為判斷標準。檢測儀器為Modular P800全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司），試劑由英國朗道公司提供。

1.2.3 潛血模擬實驗 配制紅細胞懸液，加入體檢健康者尿液（尿蛋白陰性）中以模擬“紅細胞尿”標本，依次對倍稀釋，然后進行尿常規(guī)分析。

1.2.4 尿液放置4 h后pH值對干化學法檢測尿蛋白的影響 （1）74份經測定pH值正常（5.5～6.5）但尿蛋白檢測結果不同（包括陰性和陽性）的標本放置4 h后用干化學法檢測尿蛋白；（2）將放置4 h后pH值改變的標本通過滴加弱酸（醋酸）調整pH值，恢復至正常范圍（5.5～6.5）后再次測定尿蛋白，對照pH值調整前后的測定值，以排除放置時間對pH值的干擾。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。使用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)整理，方法學的比較采用配對χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 干化學法與磺基水楊酸法尿蛋白檢測結果的比較

在2 500份隨機尿標本中，2種方法結果一致（包括相差一級）的有2 391份（95.64%），結果不一致的有109份（4.36%）。在836份尿蛋白陽性標本中，有19份干化學法陽性（1+～3+）、磺基水楊酸法陰性；有66份干化學法陰性、磺基水楊酸法陽性（1+～3+），見表1。2種方法的檢測結果之間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=2 021.51，P＜0.001）。

表1 干化學法與磺基水楊酸法尿蛋白檢測結果的比較

2.2 干化學法出現(xiàn)假陽性結果的影響因素分析

對19份干化學法陽性（1+及以上）而磺基水楊酸法陰性的標本進行尿蛋白定量檢測，結果全部為陰性，由此判定干化學法在檢測這19份標本時出現(xiàn)了假陽性。對這19份尿標本的其他常規(guī)項目異常檢測結果進行分類，其中潛血陽性13例（68%）、膽紅素陽性1例（1.5%）、pH值＞6.5 5例（26.3%）、比重≥1.03 6例（31.6%）、尿沉渣紅細胞增多7例（36.8%）。

2.3 潛血陽性（紅細胞）對干化學法檢測結果的影響

當尿液中紅細胞計數(shù)≥1×105時，尿蛋白陰性的標本干化學法檢測結果為陽性。見表2。

2.4 放置4 h后尿液pH值的改變對干化學法尿蛋白檢測結果的影響

將74份pH值正常（5.5～6.5）但尿蛋白檢測結果不同（陰性、±和1+）的標本放置4 h，所有標本的pH值均＞7.0。采用干化學法檢測這74份標本的尿蛋白，有54份（72.97%）標本的尿蛋白結果出現(xiàn)變化。21份pH值為7.0～8.5的尿液標本，其尿蛋白結果的陽性程度均高于4 h前的測定值，出現(xiàn)了假陽性。32份pH值≥8.5的標本中有15份出現(xiàn)了假陰性，17份陽性標本中有5份標本出現(xiàn)了假陰性。

將54份出現(xiàn)結果改變的標本通過滴加弱酸（醋酸）的方式調整pH值至正常范圍（5.5～6.5），發(fā)現(xiàn)其中40份尿液標本檢測結果與初始結果一致。見表3。

表2 紅細胞（不溶血）對尿蛋白結果的影響

表3 pH值對干化學法檢測結果的影響

3 討論

尿常規(guī)是臨床上最常用的檢驗項目之一。正常人尿常規(guī)中的尿蛋白檢測結果為陰性，當腎臟出現(xiàn)腎小球、腎小管疾病時，尿蛋白常呈持續(xù)異常升高。目前臨床常用的定性檢測尿蛋白的方法為干化學法。此法操作簡便、快捷，但影響結果的因素較多。因此，本研究針對可能影響尿蛋白干化學法檢測結果的因素設計模擬分析，深入探討尿蛋白干化學法的影響因素。

本研究同時采用干化學法與磺基水楊酸法檢測2 500份尿液標本，2種方法檢測結果差異較大（P＜0.001），結果一致（包括相差一級）的有2 391份（95.64%），結果不一致的有109份（4.36%）。干化學法檢測結果為陰性而磺基水楊酸法檢測結果為陽性（1+～3+）的標本有66份。造成這種差異的原因可能與干化學法檢測原理的局限性有關。干化學法利用指示劑誤差原理[5]，以溴酚藍為指示劑，其顏色的變化與結合的蛋白的量成正比，但溴酚藍主要對白蛋白敏感，對球蛋白、低相對分子質量的蛋白質及免疫球蛋白輕鏈不敏感。而磺基水楊酸法不僅僅可以檢測白蛋白，也能檢測球蛋白、本周蛋白。有研究結果顯示，干化學法主要檢測尿液中的白蛋白，對于球蛋白等其他蛋白成分的敏感性較差，基本不與這些蛋白質發(fā)生反應；當尿中球蛋白 ＜4 000 mg/L時干化學法尿蛋白結果為陰性，只有當球蛋白達到5 500 mg/L時才出現(xiàn)陽性反應；對于白蛋白/球蛋白比值為1∶2的蛋白尿，蛋白濃度高達2 000 mg/L時才會出現(xiàn)陽性反應，測定球蛋白的敏感性僅為白蛋白的1/100～1/50[6]。對于低相對分子質量的蛋白尿或溢出性蛋白尿，干化學法多呈假陰性反應[7]。有研究結果顯示，當大劑量青霉素靜脈注射患者尿液中青霉素＞40 000 U/mL時，干化學法測定尿蛋白出現(xiàn)假陰性，而磺基水楊酸法出現(xiàn)假陽性[8]。出現(xiàn)此結果差異的主要原因是由于2種方法的反應原理不同。青霉素是一種有機弱酸，進入機體后，可以釋放H+，改變環(huán)境的pH值，當用磺基水楊酸法檢測尿蛋白時，外界環(huán)境的pH值低于等電點，促使尿液中蛋白質與磺基水楊酸更容易反應，增加沉淀物的析出。青霉素本身有類似蛋白質分子結構中的肽鍵，可與磺基水楊酸結合，產生沉淀。2種因素增加了沉淀物的析出，使磺基水楊酸法檢測結果為假陽性或陽性程度高于干化學法。而當用干化學法檢測尿蛋白時，酸堿指示劑產生陰離子與帶陽離子的蛋白質結合生成復合物，但青霉素降低了環(huán)境的pH值，沒有達到酸堿指示劑的緩沖范圍，無法使指示劑發(fā)生顏色改變，導致檢測結果為假陰性。

本研究設計了模擬實驗分析造成干化學法假陽性結果的影響因素。結果顯示當尿液中紅細胞計數(shù)≥1×105時會出現(xiàn)假陽性結果，因此對于紅細胞顯著增多的不溶血的尿標本，尤其是肉眼血尿標本，當?shù)鞍锥ㄐ詸z測為陽性時不應盲目地根據(jù)尿蛋白定性結果判斷腎臟損傷程度，應同時進行尿沉渣鏡檢、尿蛋白定量檢測或其他檢查加以輔助診斷[9]。此外，pH值對尿蛋白也有很大的影響，長時間放置會使尿液標本的pH值發(fā)生改變[10]。當尿液為堿性時，尿蛋白檢測結果會出現(xiàn)假陽性。本研究結果顯示，當pH值為7.0～8.5時干化學法易出現(xiàn)假陽性，而當pH值≥8.5時則可能出現(xiàn)假陰性。上述結果表明堿性尿對干化學法有明顯的影響。這是由于該方法的“指示劑蛋白誤差原理”需在恒定的酸性條件下進行，而堿性尿會改變pH值的緩沖環(huán)境，使檢測結果易出現(xiàn)假陽性。當pH值≥8.5時出現(xiàn)假陰性的原因可能是由于在該pH值的條件下已超過了干化學法指示劑的緩沖范圍，導致無法產生顯色反應所致。一些藥物如奎寧、奎寧丁和嘧啶等均會使尿液呈強堿性（pH值≥9.0），導致干化學法尿蛋白檢測結果出現(xiàn)假陰性。

綜上所述，尿液中紅細胞的存在、pH值過高或過低以及藥物等影響都可能使干化學法出現(xiàn)與實際不符的結果。臨床上應對尿蛋白結果綜合進行分析，以免造成漏檢和誤診。