慢性HE患者腸道細菌種類與血清炎性因子相關(guān)性分析

劉冀川

（四川省腫瘤醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610041）

肝臟擁有包括肝動脈與肝門靜脈的豐富血液供應，且與腸道聯(lián)系緊密，肝門靜脈接收的血液主要是來自腸道中靜脈血液的匯入，而形成了一種肝-腸循環(huán)軸[1]。近年來對肝-腸循環(huán)軸的研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生態(tài)的變化與慢性肝功能損傷有著密不可分的關(guān)系[2]。肝硬化是一種臨床上常見的慢性肝病，呈進行性發(fā)展，發(fā)展至終末期時可出現(xiàn)多種不同程度的并發(fā)癥，包括肝性腦?。╤epatic encephalopathy，HE）[3]。HE是肝硬化最嚴重的一種并發(fā)癥，但目前尚不清楚腸道微生態(tài)在慢性HE發(fā)病中的確切機制。肝硬化發(fā)展至一定程度時出現(xiàn)的腸道微生態(tài)失衡或移位可促進機體炎性反應的產(chǎn)生[4]，然而目前尚不清楚慢性肝硬化失代償期HE與血清炎性因子變化及腸道微生態(tài)的關(guān)系。因此，本研究探討了慢性肝硬化并發(fā)HE患者腸道常見細菌與血清炎性因子[腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-12、IL-6、IL-10、IL-1β和IL-23]變化的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

從2015年8月—2017年2月在四川省腫瘤醫(yī)院住院的慢性乙型肝炎肝硬化肝功能失代償期的患者中篩選出并發(fā)HE的患者120例（HE組），其中臨床分期Ⅰ期36例、Ⅱ期50例、Ⅲ期31例、Ⅳ期3例。另選取未并發(fā)HE的慢性乙型肝炎肝硬化患者100例（對照組）。記錄所有患者的年齡、性別、肝功能指標[血清白蛋白（albumin，Alb）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TB）和凝血酶原時間（prothrombin time，PT）]變化及肝功能Child分級情況，同時測量所有患者糞便（成形）濕重。所有患者均知情同意。

1.2 納入標準和排除標準

1.2.1 納入標準 （1）符合乙型肝炎后肝硬化的診斷標準[5]：有乙型肝炎病史、存在慢性肝炎肝硬化失代償期的臨床癥狀和體征、乙型肝炎表面抗原標志物血清學檢測陽性超過半年、已出現(xiàn)肝功能異常，腹部B超和計算機斷層掃描等影像學檢查明確診斷為肝硬化失代償期；（2）HE的診斷是在肝硬化失代償期診斷的基礎(chǔ)上出現(xiàn)了以代謝紊亂為基礎(chǔ)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)的癥狀，表現(xiàn)為不同程度的意識障礙、空間定向力減弱、行為異常和神志昏迷；（3）入組前2周內(nèi)未進行任何抗病毒藥物及保肝治療、未服用微生物制劑及抗菌藥物。

1.2.2 排除標準 （1）心、肺、腎功能嚴重不全；（2）由其他原因引起的肝損傷；（3）其他部位有感染征象；（4）糖尿病以及上消化道大出血；（5）使用糖皮質(zhì)激素及抗精神病類藥物；（6）長期酗酒并患有各類精神、神經(jīng)疾病；（7）存在胃腸道創(chuàng)傷或有外科手術(shù)史。

1.3 指標檢測

1.3.1 腸道微生態(tài)變化 采用熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測所有患者腸道中12種常見細菌的分布情況。收集患者晨起經(jīng)隱血實驗證實為陰性且未受尿液污染的尾便，置無菌樣本收集器中，攪勻后稱重，取200 mg分裝于無菌Eppendorf管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩＝y(tǒng)一進行糞便總DNA提取和PCR。各類細菌的引物序列參照GenBank（https：//en.wikipedia.org/wiki/Gene_bank）進行合成，本研究設(shè)計的細菌引物序列見表1。PCR后再進行熒光定量PCR檢測，最后將定量檢測到的糞便DNA拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換為對數(shù)值并進行分析。采用細菌16S rRNA作為內(nèi)參基因。

1.3.2 血清TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10檢測 采用無菌管采集所有患者清晨空腹全血5 mL，靜置30 min，278×g離心5 min，取上清，分裝于無菌Eppendorf管中進行血清炎性因子的檢測或置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。血清TNF-α、IL-12、IL-6和IL-10采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測，試劑盒購自武漢碧云天有限公司，檢測步驟嚴格按照操作說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗。計量指標之間的相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析；肝功能Child分級與菌落或血清炎性標志物之間的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 細菌引物序列

2 結(jié)果

2.1 HE組與對照組基本情況及肝功能指標比較

HE組與對照組之間一般指標、糞便濕重及PT差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但血清Alb、ALT、AST、TB以及肝功能Child分級差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.2 HE組與對照組腸道細菌種類比較

與對照組比較，HE組顯著增殖的腸道細菌有腸致病性大腸埃希菌、假單胞菌屬、腸球菌屬、普雷沃登菌屬、葡萄球菌屬、梭菌屬和白念珠菌（P＜0.05）。顯著減少的細菌有雙歧桿菌、鏈球菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌和瘤胃球菌屬。除鏈球菌屬和擬桿菌屬外，其他細菌差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.3 HE組與對照組血清TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10、IL-1β和IL-23水平的比較

HE組血清TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10、IL-1β和IL-23水平均明顯高于對照組（P＜0.001）。見表4。

2.4 HE組與對照組腸道細菌與肝功能指標的相關(guān)性分析

HE組腸道中致病性大腸埃希菌與Alb呈負相關(guān)，與ALT、AST及肝功能Child分級呈正相關(guān)，鏈球菌屬與TB及PT呈正相關(guān)，假單胞菌屬與Alb、TB及肝功能Child分級呈正相關(guān)，普雷沃登菌屬與ALT呈負相關(guān)，乳酸桿菌與Alb、ALT及AST呈正相關(guān)，瘤胃球菌屬與Alb、ALT及肝功能Child分級呈負相關(guān)，梭菌屬與ALT及TB呈負相關(guān)。對照組中只有致病性大腸埃希菌與肝功能指標相關(guān)。見表5、表6。

2.5 HE組與對照組腸道細菌與血清炎性因子的相關(guān)性分析

HE組致病性大腸埃希菌與IL-12、IL-10和IL-23呈正相關(guān)；雙歧桿菌與TNF-α和IL-23呈負相關(guān)，與IL-12和IL-1β呈正相關(guān)；鏈球菌屬與IL-10呈正相關(guān)；腸球菌屬與TNF-α、IL-10呈正相關(guān)，與IL-12呈負相關(guān)；擬桿菌屬與TNF-α、IL-10及IL-23呈正相關(guān)；普雷沃登菌屬與TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-23均呈正相關(guān)；乳酸桿菌與IL-6和IL-10呈負相關(guān)；瘤胃球菌屬與IL-12、IL-1β及IL-23呈負相關(guān)；梭菌屬與IL-12、IL-10呈正相關(guān)，與IL-6呈負相關(guān)。對照組中只有致病性大腸埃希菌與6種炎性因子相關(guān)。見表7、表8。

表2 HE組與對照組基本情況及肝功能指標的比較

表3 HE組與對照組腸道常見細菌比較

表3 HE組與對照組腸道常見細菌比較

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表4 HE組與對照組血清TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10、IL-1β和IL-23水平的比較 （pg/mL，

表4 HE組與對照組血清TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10、IL-1β和IL-23水平的比較 （pg/mL，

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表5 HE組腸道細菌與肝功能指標的相關(guān)性

表6 對照組腸道細菌與肝功能指標的相關(guān)性分析

表7 HE組腸道細菌與血清炎性因子的相關(guān)性

3 討論

人體腸道正常微生態(tài)的主要成分是專性厭氧菌，包括雙歧桿菌、球菌和乳酸桿菌，而其他的兼性需氧菌是指一類無致病性的大腸埃希菌、鏈球菌和腸球菌，盡管這類細菌在正常情況下對人體無害，但是當腸道環(huán)境改變時會轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【?011年，ARUMUGAM等[6]檢測了人體正常腸道中的厭氧菌宏基因組序列，結(jié)果顯示這些非隨機組合的腸道細菌可以大致分為擬桿菌屬、普雷沃登菌屬和瘤胃球菌屬，并且這些菌屬均與人的年齡、性別、人種、體重指數(shù)以及區(qū)域環(huán)境無關(guān)[6]。有研究結(jié)果顯示，在慢性乙型肝炎和由其所致的肝硬化患者中，存在著不同程度的腸道微生態(tài)失衡現(xiàn)象，而且菌屬的多樣性也較差[7]。

肝硬化發(fā)展至一定程度時，腸道微生態(tài)受到破壞，使腸道防御能力下降而導致微生態(tài)失衡或細菌移位，引發(fā)機體出現(xiàn)免疫炎性反應，釋放的一系列炎性細胞因子（TNF-α、IL-12、IL-6、IL-1β、IL-23、IL-10等）產(chǎn)生級聯(lián)反應[8-9]，損傷機體重要臟器，其中就包括肝臟。本研究結(jié)果顯示，HE組肝功能異常程度明顯高于對照組（P＜0.05），而且上述6種炎性因子水平也要明顯高于對照組（P＜0.05），表明肝功能異常程度可能與免疫炎性因子的異常表達有關(guān)。此外，因為肝功能指標是對肝臟功能受損程度最直接的反映，且大多數(shù)HE患者腸道細菌與不同肝功能指標存在不同程度的相關(guān)性，這意味著腸道微生態(tài)的失衡可能與HE的發(fā)生及病情進展相關(guān)。然而腸道細菌的種類與慢性肝病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系如何以及二者的相關(guān)作用機制目前尚不明確。本研究中結(jié)果顯示，HE患者腸道中的不同細菌出現(xiàn)顯著增殖或顯著減少，說明肝硬化并發(fā)HE的患者腸道微生態(tài)嚴重失衡，這與文獻報道[10-11]一致。腸道微生態(tài)有調(diào)節(jié)免疫炎性因子產(chǎn)生和釋放的作用。陳萌萌[12]的研究結(jié)果顯示，慢性乙型肝炎及其所致肝硬化患者除腸道微生態(tài)失衡外，腸道細菌種類還與多種炎性因子存在相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，大多數(shù)HE患者腸道細菌與TNF-α、IL-12、IL-6、IL-1β、IL-23、IL-10相關(guān)，而且相關(guān)的細菌種類和程度均高于對照組，表明HE患者腸道中異常增殖的細菌產(chǎn)生了更多、范圍更廣的炎性反應，激活了機體免疫炎性細胞。這些活化的免疫細胞產(chǎn)生了大量的細胞因子和炎性因子，從而加重了肝臟的炎性反應和組織損傷[13-14]，進一步使得肝功能減退，加重了HE病情。

綜上所述，腸道微生態(tài)失衡可能參與慢性乙型肝炎肝硬化并發(fā)HE發(fā)生、發(fā)展及肝功能損傷過程，并且多種免疫炎性因子產(chǎn)生和分泌的協(xié)同調(diào)控可能也與HE發(fā)展的病理機制相關(guān)。