抗結(jié)核分枝桿菌多表位融合抗原IgG抗體檢測最佳臨界值的建立和初步應用

戚應杰，石玉如，劉 婷，岳 莉，趙長城，王 云，馬筱玲

（1. 安徽省立醫(yī)院感染病院檢驗科，安徽 合肥 230022；2. 安徽省立醫(yī)院，安徽 合肥 230022）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一種傳染病，最常見的患病部位是肺部。2012年，全球約有860萬例結(jié)核新發(fā)病例，約130萬人死于結(jié)核病[1]，結(jié)核病已成為影響全球的重大公共衛(wèi)生問題?？煽?、準確的檢測方法是結(jié)核病診斷和治療的關鍵。目前，MTB培養(yǎng)或影像學檢查仍是診斷結(jié)核病的金標準。MTB特異性分泌蛋白的抗體檢測對結(jié)核病的診斷具有重要的意義。利用基因工程技術將MTB的特異性分泌蛋白制成融合蛋白，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清中的特異性抗體對于結(jié)核病的診斷有重要的臨床意義[2]。但有研究結(jié)果顯示，ELISA的結(jié)果易受實驗中多種因素和Cut-off值設定的影響，普遍存在準確性和重復性不高的缺點[3-5]。本研究擬建立抗結(jié)核分枝桿菌多表位融合抗原IgG抗體（anti-multi-epitope fusion antigen IgG antibody of Mycobacterium tuberculosis，MTB-Ab）檢測的最佳臨界值，并評價其在肺結(jié)核診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年5月—2016年12月安徽省立醫(yī)院感染病院結(jié)核科門診及住院的肺結(jié)核患者120例，其中活動性肺結(jié)核62例、非活動肺結(jié)核58例，診斷標準均符合2001年中華醫(yī)學會結(jié)核病學分會制定的肺結(jié)核診斷標準。以同期安徽省立醫(yī)院感染病院168名體檢健康者作為正常對照組。各組間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。所有患者甲、乙型肝炎病毒感染指標均為陰性，未合并其他急性感染性疾病。

1.2 方法

采集所有對象清晨空腹肘靜脈血4 mL，2 000×g離心10 min，分離血清，-80 ℃保存待測。檢測儀器為STAT FAX2100酶標儀（美國Awareness公司），MTB-Ab ELISA檢測試劑盒購自上海榮盛公司，嚴格按標準操作程序進行操作。試劑盒說明書建議的Cut-off值為陰性對照平均吸光度（A）值+0.12，取0.18。將樣本孔A值/Cut-off值定義為Cut-off值指數(shù)（cut-off index，COI）。室內(nèi)質(zhì)控在控后進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。分別以正常對照組和非活動性肺結(jié)核組為對照繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，使用Medcalc 15.10軟件確定最佳Cut-off值，計算最佳COI值，以此作為自建臨界值計算敏感性、特異性、約登指數(shù)、陽性似然比、陰性似然比、陽性預測值和陰性預測值，并與以試劑盒Cut-off值為臨界值得出的診斷性能進行比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTB-Ab診斷肺結(jié)核的最佳COI值

以正常對照組為對照，MTB-Ab診斷肺結(jié)核的曲線下面積（area under curve，AUC）[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）]為0.891（0.852～0.930），最佳COI值（COI1）為0.90，此時敏感性為92.50%，特異性為82.10%；以非活動性肺結(jié)核組為對照，MTBAb診斷活動性肺結(jié)核的AUC（95%CI）為0.721（0.632～0.799），最佳COI值（COI2）為3.65，此時敏感性為79.03%，特異性為62.07%。

圖1 MTB-Ab診斷肺結(jié)核的ROC曲線

2.2 肺結(jié)核組與正常對照組COI值比較

肺結(jié)核組COI值為4.57（1.15～6.85），明顯高于正常對照組[1.25（0.31～2.90）]（P＜0.05）?；顒有苑谓Y(jié)核組COI值為6.52（4.27～11.98），明顯高于非活動性肺結(jié)核組[3.12（2.35～5.02）]（P＜0.05）。見圖2。

圖2 正常對照組與肺結(jié)核組之間COI值的比較

2.3 不同臨界值的診斷性能比較

分別以試劑盒Cut-off值（0.18）、COI1（0.90）及COI2（3.65）作為診斷肺結(jié)核的臨界值，進行診斷性能評價。結(jié)果顯示，COI1的敏感性高于試劑盒Cut-off的敏感性（P＜0.05），特異性、約登指數(shù)、陽性似然比、陰性似然比、陽性預測值、陰性預測值二者之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；COI2的敏感性、特異性、約登指數(shù)、陽性似然比、陽性預測值、陰性預測值均顯著低于COI1（P＜0.05），而陰性似然比顯著高于COI1（P＜0.05）。見表1。

表1 不同臨界值下MTB-Ab診斷肺結(jié)核的性能評價

3 討論

雖然結(jié)核病的防控取得了一定的成效，但目前全球每年仍有大約150萬人死于結(jié)核病[6]。結(jié)核病防治面臨的挑戰(zhàn)是多方面的，包括獲得性免疫缺陷綜合征與結(jié)核病的雙重感染、缺乏有效的疫苗、不斷出現(xiàn)的耐多藥MTB[7]等，其中最重要的一點是沒有特異性的生物標志物，無法對結(jié)核病作出早期診斷[8-9]。結(jié)核病患者外周血MTB抗體的檢測具有簡便、快捷的特點，但因其抗原的特異性不高、干擾因素多和受Cut-off值設定等的影響，造成其診斷準確性不高[5]，不能作為單獨的診斷標準。目前的診斷試劑并不能滿足臨床需要，導致血清學診斷在結(jié)核病中的診斷價值一直存在爭議。

本研究采用的商品化試劑盒的成分為利用基因工程技術克隆表達的致病性MTB的7種結(jié)核特異性表位抗原，通過將7種特異性抗原（38 000、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3）優(yōu)勢肽段分別制備成融合抗原來提高抗原的特異性[10-12]。利用多表位MTB特異性融合抗原檢測MTB抗體成為近年來不少學者研究的熱點。血清學診斷在結(jié)核病中的診斷價值有望被重新挖掘。周鵬等[13]聯(lián)合MTB 7種特異性抗原檢測患者血清中的抗體，結(jié)果顯示多種抗原聯(lián)合檢測可提高MTB抗體檢測的敏感性，7種抗原在血清抗體檢測中具有抗原互補性，不同抗原與機體反應存在不同的反應模式。本研究同時使用全自動酶標儀、標準操作程序和最佳COI值來消除傳統(tǒng)方法檢測MTB抗體的影響[14]，并評價MTB-Ab診斷肺結(jié)核的價值。

本研究結(jié)果顯示，正常對照組與肺結(jié)核組之間、活動性肺結(jié)核與非活動性結(jié)核組之間COI值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。ROC曲線分析顯示，MTB-Ab診斷肺結(jié)核的AUC（95%CI）為0.891（0.852～0.930），說明用MTB-Ab診斷MTB感染具有較高的準確性；以正常對照組為對照得出的最佳COI值（COI1）為0.90，此時敏感性為92.50%，特異性為82.10%。本研究進一步對2個臨界值的診斷性能進行了評價，結(jié)果顯示COI1的敏感性高于試劑盒Cut-off值（P＜0.05），說明通過ROC曲線確定最佳COI值比試劑盒Cutoあ值在結(jié)核病的診斷上更有價值。

本研究結(jié)果還顯示，以非活動性肺結(jié)核組為對照得出的最佳COI值（COI2）作為臨界值時，其主要性能指標（敏感性、特異性、約登指數(shù)、陽性似然比、陽性預測值、陰性預測值）與COI1比較均明顯降低，陰性似然比則明顯升高，說明對活動性肺結(jié)核的診斷性能反而下降了。由此可見，MTB-Ab檢測在鑒別診斷活動性肺結(jié)核與非活動性肺結(jié)核中不理想，還有待進一步改進。

綜上所述，MTB-Ab具有較高的臨床診斷價值，以最佳COI值作為臨界值可獲得最大診斷效能，可以為結(jié)核病的診斷提供依據(jù)。