上海地區(qū)兒童快速免疫層析法cTnI參考區(qū)間的建立

鄭建新， 楊 慧， 傅啟華

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心，上海 200127）

急性心肌損傷的早期診斷是降低兒童病死率的關(guān)鍵。目前，臨床診斷心肌損傷的實驗室檢測指標(biāo)有肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶MB同工酶（creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB）及肌鈣蛋白等[1-2]。肌鈣蛋白是橫紋肌收縮的重要調(diào)節(jié)蛋白[3]，由3個亞基組成。心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）具有高度的心肌特異性，可用于檢測微小的心肌損傷。cTnI在外周血中出現(xiàn)較早且持續(xù)時間較長，因此可作為心肌損傷檢測敏感性和特異性最強的標(biāo)志物之一，目前主要用于快速診斷急性心肌梗死、監(jiān)測心臟手術(shù)及其預(yù)后[4]。兒童心肌損傷常見于窒息缺氧、先天性心臟病、心臟移植、病毒和細(xì)菌感染、川崎病、心臟外科手術(shù)、使用心臟毒性藥物、冠狀動脈發(fā)育異常、新生兒心肌梗死、代謝性心肌病等，且心肌損傷后病情進展迅速。目前，cTnI檢測試劑生產(chǎn)廠商提供的參考區(qū)間為該方法的功能靈敏度（臨界值），且多以成人為對象，尚缺乏兒童的參考區(qū)間，而兒童因其自身的生理特點與成人有異，因此建立上海地區(qū)兒童外周血cTnI參考區(qū)間顯得尤為迫切。為此，本研究采用快速免疫層析法檢測健康兒童末梢血cTnI，初步建立該方法的兒童末梢血cTnI參考區(qū)間。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年11月1日—2017年4月31日上海兒童醫(yī)學(xué)中心兒保科完成調(diào)查問卷并符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的7個月～12歲體檢健康兒童240名，其中男108名、女132名。所有入選兒童血、尿常規(guī)及肝、腎功能均正常。調(diào)查問卷內(nèi)容主要包括研究對象的發(fā)育及營養(yǎng)狀況、有無心腎肝肺等重要臟器疾病、有無近期服藥史，不涉及兒童姓名。同時查閱研究對象的門診病歷卡，保證調(diào)查問卷內(nèi)容屬實。排除發(fā)熱、有心臟疾病史、有嚴(yán)重呼吸道疾病史以及近6個月有感染史、使用過藥物的兒童。

1.2 儀器與試劑

銳普200熒光免疫分析儀（加拿大Response Biomedical公司）及配套試劑（快速免疫層析法）、質(zhì)控品（RAMP cardiac control，批號241013）。Dade Dimension RxL全自動化學(xué)發(fā)光儀（德國西門子公司）及配套試劑（化學(xué)發(fā)光法）。

1.3 樣本采集及測定

采集所有兒童手指末梢血后保存于乙二胺四乙酸抗凝管中，室溫保存，2 h內(nèi)完成檢測。當(dāng)日測定樣本前測定1次質(zhì)控品。嚴(yán)格按儀器及試劑說明書進行操作。

1.4 方法學(xué)評估

在檢測cTnI前先對銳普200熒光免疫分析儀及配套試劑組成的檢測系統(tǒng)進行方法學(xué)評估，以確定本方法是否能用于兒童末梢血cTnI檢測。

1.4.1 準(zhǔn)確性 將高值質(zhì)控品（4.69 ng/mL）和低值質(zhì)控品（0.47 ng/mL）作為樣本進行檢測，每個水平重復(fù)檢測10次，計算均值（）。高、低值質(zhì)控品測定值應(yīng)在質(zhì)控品標(biāo)示的預(yù)期范圍（低值為0.38～0.57 ng/mL，高值為3.75～5.63 ng/mL）內(nèi)。

1.4.2 精密度 （1）日內(nèi)精密度：將高、低值質(zhì)控品作為樣本平行測定10次，計算x 、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）；（2）日間精密度：將高、低值質(zhì)控品作為樣本平行測定5次，連續(xù)檢測5 d，計算、s和CV。

1.4.3 最低檢測限 將低值質(zhì)控品用生理鹽水稀釋16倍，至最低檢測限0.03 ng/mL附近，然后進行檢測，重復(fù)測定20次，計算和s，以+2s作為最低檢測限，其結(jié)果應(yīng)＜0.03 ng/mL。

1.4.4 線性范圍驗證 將廠商提供的線性質(zhì)控品用專用稀釋液稀釋到原來濃度的3/5，得到可讀范圍的高值（26.40 ng/mL），記為點1；另取質(zhì)控品稀釋到原來濃度的1/2（22.00 ng/mL），記為點2。對點2的濃度進行倍比稀釋，分別記為點3（11.00 ng/mL）、點4（5.50 ng/mL）、點5（1.10 ng/mL）、點6（0.55 ng/mL）、點7（0.028 ng/mL）。每一個濃度樣本均重復(fù)檢測3次，計算。用最小二乘法計算實測值與預(yù)期值的r值。

1.4.5 方法比對 將本方法與化學(xué)發(fā)光法進行比對并溯源。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。按Dixon法剔除離群值，如果D/R＞1/3，那該值便作為離群值被剔除，其中R為極差（當(dāng)前所有值中最大值和最小值之差）、D為可疑值與下一個最值之間差值的絕對值。以百分位數(shù)法確定參考區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 離群值檢驗

Dixon法結(jié)果顯示無離群值，因此保留所有測定數(shù)據(jù)。

2.2 方法學(xué)評價

2.2.1 準(zhǔn)確度 高、低值質(zhì)控品的檢測結(jié)果分別為4.73和0.49 ng/mL，均在質(zhì)控品說明書標(biāo)示的預(yù)期范圍內(nèi)。

2.2.2 精密度 低值質(zhì)控品日間和日內(nèi)精密度（CV）分別為5.97%和6.35%，高值質(zhì)控品日間和日內(nèi)精密度（CV）分別為5.36%和7.14%，均符合廠家聲明的要求（CV＜10%）。見表1。

表1 精密度驗證結(jié)果

2.2.3 最低檢測限 低值質(zhì)控品稀釋16倍后的檢測結(jié)果為0.02 ng/mL，符合廠家聲明的要求（最低檢測限＜0.03 ng/mL）。

2.2.4 線性范圍驗證 在0.028～26.400 ng/mL范圍內(nèi)實測值與預(yù)期值呈正相關(guān)（r=0.998 3），線性方程為Y=0.997 4X+0.377 6（r2=0.996 6），符合廠商聲明的線性范圍要求。見圖1。

圖1 線性范圍驗證結(jié)果

2.2.5 方法學(xué)比對 相關(guān)性分析顯示快速免疫層析法（Y）與化學(xué)發(fā)光法（X）的相關(guān)性良好，回歸方程為Y=0.456X+0.011（r=0.988）?？焖倜庖邔游龇z測cTnI的第99百位數(shù)值為0.1 ng/mL，第99百位數(shù)值的不精密度為18.5%。見圖2。

圖2 快速免疫層析法與化學(xué)發(fā)光法的相關(guān)性

2.3 參考區(qū)間建立

將240名兒童的cTnI檢測結(jié)果繪制直方圖，見圖3。從圖3可以看出數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，因此采用百分位數(shù)法進行分析。計算99%參考區(qū)間上限值，得出參考區(qū)間上限值為0.5 ng/mL。若根據(jù)廠家給出的參考區(qū)間（＜0.3 ng/mL）判斷，240名體檢健康兒童中有200名（83.3%）cTnI＜0.3 ng/mL，有40名（16.7%）cTnI＞0.3 ng/mL。將240名體檢健康兒童按性別分別統(tǒng)計，其結(jié)果分布狀態(tài)無明顯變化。因此，根據(jù)99%參考區(qū)間上限值，同時結(jié)合試劑說明書中標(biāo)示的參考區(qū)間（＜0.3 ng/mL），確定基于快速免疫層析法的兒童末梢血cTnI參考區(qū)間：＜0.3 ng/mL為陰性、＞0.5 ng/mL為陽性。對于cTnI為0.3～0.5 ng/mL的兒童，臨床需結(jié)合其癥狀及體征進一步進行相關(guān)輔助檢查，以判斷其是否有心肌損傷。

3 討論

中國合格評定國家認(rèn)可委員會CL-02《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》規(guī)定應(yīng)定期評審生物參考區(qū)間。美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會C28-A3文件強調(diào)確立一個可靠的參考區(qū)間時，可引用參考區(qū)間并進行驗證，驗證不通過時應(yīng)建立適合本實驗室的參考區(qū)間。

cTnI不僅具有較好的器官特異性，而且窗口期較長，是反映心肌損傷理想的標(biāo)志物[5-6]。與CK-MB相比，cTnI的相對分子質(zhì)量較小，心肌損傷后更容易被釋放入血。cTnI 是心肌受到不可逆損傷時釋放出的一種蛋白質(zhì)，對心肌組織具有很高的特異性[7]。當(dāng)心肌細(xì)胞膜受損時，游離于胞漿中的cTnI被釋放到細(xì)胞外，使血清cTnI水平升高，其水平與心肌損傷面積的大小成正比。有研究結(jié)果顯示，cTnI在急性心肌梗死發(fā)病12～72 h時的敏感性為100%，而72～150 h時僅為18%[9]。兒童的參考區(qū)間由于其自身的生理特點不同于成人，但試劑說明書中一般只提供18歲及以上健康成人的參考區(qū)間。近年來，各兒童醫(yī)院臨床實驗室越來越重視根據(jù)檢測系統(tǒng)建立適合自己實驗室的參考區(qū)間。建立一個適合本實驗室的cTnI參考區(qū)間是非常重要的，可以為心肌損傷患兒提供診斷、預(yù)后判斷及療效評價。本研究結(jié)果顯示使用廠商提供的參考區(qū)間（＜0.3 ng/mL）進行判讀，有16.7%（40/240）的兒童cTnI異常，然而這部分兒童血、尿常規(guī)及肝、腎功能指標(biāo)均正常，心電圖也無異常。由此可見，廠家說明書給出的參考區(qū)間（＜0.3 ng/mL）過低，不適用于上海地區(qū)兒童末梢血cTnI檢測結(jié)果的判斷。本研究通過分析240名健康兒童的cTnI檢測結(jié)果，計算99%參考區(qū)間上限值為0.5 ng/mL。為避免臨床對就診兒童的誤判，確定基于快速免疫層析法的兒童末梢血cTnI參考區(qū)間，即＜0.3 ng/mL為陰性、＞0.5 ng/mL為陽性。對于cTnI為0.3～0.5 ng/mL的兒童，臨床需結(jié)合其癥狀、體征并進一步進行相關(guān)輔助檢查，以判斷其是否有心肌損傷。總之，本研究建立的參考區(qū)間有助于臨床醫(yī)生更好地結(jié)合患兒實際情況進行疾病的判斷并指導(dǎo)治療。