消腫止痛液有效部位軟膏的制備工藝及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李曉

1.銀川市中醫(yī)醫(yī)院，寧夏 銀川 750001；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750001

痔瘡是肛腸科多發(fā)病，寧夏回族自治區(qū)地處西北，人們喜食牛羊肉、善飲酒等生活習(xí)慣導(dǎo)致痔瘡發(fā)病率較高。據(jù)流行病學(xué)研究[1]，該地區(qū)痔瘡患病率高達(dá)40.06%。消腫止痛液(批準(zhǔn)文號(hào)：寧藥制字Z20140005)是銀川市中醫(yī)醫(yī)院肛腸科臨床使用二十多年的醫(yī)院制劑，主要由地榆、黃柏、大黃等八味中藥組成，用于治療各種原因所致的痔瘡初期及外痔、混合痔、肛裂和痔瘡術(shù)后的消腫止痛，療效確切[2]。我院制劑中心對(duì)其進(jìn)行了洗液制備工藝[3]和薄層鑒別研究。隨著生活節(jié)奏的加快，外用洗劑攜帶不方便，使用方法繁瑣以及存儲(chǔ)困難，不能滿足患者需求，軟膏制劑使用和攜帶方便，患者依從性好，因?qū)ο[止痛液進(jìn)行二次開(kāi)發(fā)，旨在開(kāi)發(fā)療效確切，使用便捷的軟膏制劑。前期通過(guò)對(duì)消腫止痛液的各部位成分進(jìn)行富集，藥效篩選得到有效部位，本論文將對(duì)有效部位軟膏的制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TU-1901型紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；XA105型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；YP4002型電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；JJ-1型精密增力電動(dòng)攪拌器(金壇市城西崢嶸試驗(yàn)儀器廠)；DZTW型調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；TGL-15B型高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 材料 消腫止痛液有效部位(銀川市中醫(yī)醫(yī)院制劑中心實(shí)驗(yàn)室自制)；硬脂酸(批號(hào)：101820150901，湖南爾康制藥股份有限公司)；羥苯乙酯(批號(hào)：103620170605，湖南爾康制藥股份有限公司)；三乙醇胺(批號(hào)：20170401，成都華邑藥用輔料制造有限責(zé)任公司)；甘油(批號(hào)：000120161004，湖南爾康制藥股份有限公司)；沒(méi)食子酸(批號(hào)：110831-201605，純度90.8%)、鹽酸小檗堿(批號(hào)：110713-201212)、大黃素(批號(hào)：110756-201512)、大黃對(duì)照藥材(批號(hào)：121249-201304)、黃柏對(duì)照藥材(批號(hào)：121510-201606)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。硅膠G薄層板(青島海洋化工廠分廠)。所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 基質(zhì)類型考察及藥物準(zhǔn)備 消腫止痛液有效部位軟膏用于肛周局部給藥，根據(jù)給藥部位特點(diǎn)，肛周皮膚濕性重，并易產(chǎn)生分泌物[4]，故選用O/W乳膏基質(zhì)，不僅可吸附分泌物，還具有易于涂布和清洗的特點(diǎn)。參考《寧夏醫(yī)院制劑規(guī)范》收載的“乳膏基質(zhì)1號(hào)”進(jìn)行基質(zhì)優(yōu)化。消腫止痛液有效部位藥物細(xì)粉，過(guò)六號(hào)篩，備用。

2.2 乳化工藝考察[5]

2.2.1 試驗(yàn)方法與質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)

2.2.1.1 離心試驗(yàn)高度比(Y1) 按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)制備軟膏，分別稱取樣品20 g，置于內(nèi)徑為1 cm離心管中，以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min，取出，測(cè)量離心管中分離出的油層高度(Ho)、水層高度(Ha)及總高度(Ht)，計(jì)算高度比(Y1)。計(jì)算公式:Y1=(Ho+Ha)/Ht

2.2.1.2 高溫試驗(yàn)高度比(Y2) 按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)制備軟膏，分別稱取樣品20g，置于內(nèi)徑為1 cm的試管中，于60℃水浴靜置5 h，測(cè)量離心管中分離出的油層高度(Ho)、水層高度(Ha)及總高度(Ht)，計(jì)算高度比(Y2)。計(jì)算公式同上。

2.2.1.3 綜合評(píng)分 將Y1、Y2歸一化為評(píng)價(jià)指標(biāo)Y進(jìn)行綜合評(píng)分。兩個(gè)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)均為0.5，當(dāng)軟膏中油、水兩相完全分層時(shí)，Y1或Y2值為1，Y1和Y2越小越好，即綜合評(píng)分(Y)=[(1-Y1i)×0.5+(1-Y2i)×0.5]×100。

2.2.1.4 正交設(shè)計(jì) 根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，以藥物與基質(zhì)比例(A)、乳化時(shí)間(B)和乳化溫度(C)為影響因素，以離心試驗(yàn)高度比(Y1)和高溫試驗(yàn)高度比(Y2)綜合評(píng)分，并結(jié)合軟膏的外觀形狀對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，優(yōu)選消腫止痛有效部位軟膏乳化工藝。

2.2.2 試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析 按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行離心試驗(yàn)和高溫試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

表3 方差分析表

注：F0.05(2，2)=19.0；F0.01(2，2)=99.0。

綜合評(píng)分越高，表明軟膏的穩(wěn)定性越好，表3方差分析結(jié)果顯示A因素對(duì)離心試驗(yàn)和高溫試驗(yàn)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且A3>A2>A1，即藥物與基質(zhì)比第3水平1∶9最為適宜；B和C兩個(gè)因素試驗(yàn)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且B3>B2>B1，C3>C2>C1，因此軟膏乳化時(shí)間第3水平即30 min，加熱溫度為90 ℃，考慮實(shí)際生產(chǎn)溫度控制，故溫度控制在80 ℃較為合適。由此可知消腫止痛液有效部位軟膏的最佳制備工藝為硬脂酸、石蠟、液體石蠟80 ℃共融作為油相；三乙醇胺、甘油、羥苯乙酯溶液(5%)、水共同加熱至80 ℃作為水相，同時(shí)將藥物細(xì)粉與基質(zhì)按1∶9加入少量乙醇超聲溶解，趁熱加入水相，水相倒入油相，攪拌30 min，放冷至室溫即得。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述制備工藝平行制備3批消腫止痛液有效部位軟膏，處方量為100 g，并按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行離心試驗(yàn)和高溫試驗(yàn)，從兩相的分層情況、外觀(顏色均勻度、軟硬度及細(xì)膩程度)評(píng)價(jià)軟膏制備工藝的合理性。結(jié)果表明，3份樣品經(jīng)高溫、離心試驗(yàn)后均無(wú)分層，外觀各項(xiàng)均符合要求。

2.4 大黃的鑒定[6]取軟膏5.0 g，加入40%乙醇40 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9～10，用乙酸乙酯振搖萃取2次，每次20 mL，棄去乙酸乙酯液，水層加入鹽酸2 mL，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)眉状? mL溶解，作為供試品溶液。按處方稱取缺大黃的其他藥材，分離得到有效部位藥物，并按軟膏制備工藝制成缺大黃的陰性樣品，同法制備缺大黃的陰性對(duì)照溶液。另取大黃對(duì)照藥材0.10 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再稱取大黃素，用甲醇配制成65.23 μg/mL對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述四種溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視，再置于氨蒸氣中觀察斑點(diǎn)顏色變化。結(jié)果，供試品色譜中在與對(duì)照藥材色譜對(duì)應(yīng)處，可見(jiàn)5個(gè)斑點(diǎn)顯橙黃色熒光；在與對(duì)照品色譜對(duì)應(yīng)處，可見(jiàn)相同顏色的斑點(diǎn)；用氨蒸氣熏蒸后，可見(jiàn)斑點(diǎn)顯紅，陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

2.5 黃柏的鑒別[7-8]供試品溶液制備方法同“2.4”項(xiàng)下第一次乙酸乙酯振搖萃取后即合并提取液，蒸干，殘?jiān)眉状? mL溶解，作為供試品溶液，同法制備缺黃柏的陰性對(duì)照溶液，另取黃柏對(duì)照藥材0.10 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再稱取鹽酸小檗堿，用甲醇配制成55.63 μg/mL對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述四種溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(10∶5∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。結(jié)果，供試品色譜中在與對(duì)照藥材色譜對(duì)應(yīng)處，可見(jiàn)黃綠色熒光斑點(diǎn)；在與對(duì)照品色譜對(duì)應(yīng)處，可見(jiàn)相同顏色的斑點(diǎn)；陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

2.6 總鞣質(zhì)含量測(cè)定[9-12]

2.6.1 溶液配制

2.6.1.1 磷鉬鎢酸試液的配制 取鎢酸鈉100 g，鉬酸鈉25 g，加水700 mL使溶解，加鹽酸100 mL，磷酸50 mL，加熱回流10 h，放冷，再加硫酸鋰150 g，水50 mL和溴0.2 mL，煮沸除去殘留的溴(約15 min)。冷卻，加水稀釋至1000 mL，濾過(guò)，即得。另外，磷鉬鎢酸試液不得顯綠色(如放置后變?yōu)榫G色，可加溴0.2 mL，煮沸出去多余的溴，可恢復(fù)原色。)

2.6.1.2 29%碳酸鈉溶液的配制 稱取無(wú)水碳酸鈉29 g，溶于100 mL蒸餾水中，即得。(不溶解可水浴加熱并不斷攪拌至溶解，需現(xiàn)用現(xiàn)配。)

2.6.1.3 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品0.0504 g(純度90.8%)，置于100 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得45.76 μg/mL對(duì)照品溶液。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液1，2，4，6，8，10 mL，分別置50 mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液2 mL，再分別加水23，22，20，18，16，14 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法(通則0401)，在760 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為：Y=100.65x+0.3108(r=0.9996)，沒(méi)食子酸在0.0229～0.2290 mg吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.6.3 供試品溶液的制備[13]取供試品1.00 g，精密稱定至100 mL棕色容量瓶，加水在80 ℃水浴中加熱2 h并時(shí)時(shí)振搖，放冷，置冰浴中冷卻1 h，迅速用濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，精密量取5 mL，置100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.6.4 總酚的測(cè)定 精密量取“2.6.3”項(xiàng)下供試品溶液4 mL，置50 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液2 mL，加水20 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min以不加供試品的試劑為空白依法測(cè)定吸光度，從“2.6.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒(méi)食子酸的濃度(μg/mL)，計(jì)算，即得。

2.6.5 不被吸附的多酚的測(cè)定 精密量取供試品溶液25 mL，加至已盛有干酪素0.6 g的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置30 ℃水浴中保溫1 h，時(shí)時(shí)振搖，取出，放冷，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液4 mL，置50 mL棕色量瓶中，后同“2.6.4”項(xiàng)下操作相同，測(cè)得沒(méi)食子酸的濃度(μg/mL)，計(jì)算，即得。

2.6.6 總鞣質(zhì)的測(cè)定 總鞣質(zhì)的含量=總酚量-不被吸收多酚量

2.6.7 專屬性考察 取供試品溶液按“2.6.4”和“2.6.5”項(xiàng)下方法制備樣品，在190～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果在760 nm有最大吸收，與對(duì)照品相同，表明其他成分對(duì)鞣質(zhì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.6.8 精密度考察 精密量取對(duì)照品溶液4 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加磷鉬鎢酸試液2 mL，加水20 mL，用29%碳酸鈉溶液定容，放置30 min，以相應(yīng)試劑為空白，平行測(cè)定吸光度值5次，計(jì)算RSD為0.06%，表明該方法精密度良好。

2.6.9 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h測(cè)定總鞣質(zhì)的含量，結(jié)果總鞣質(zhì)的平均含量為24.85 mg/g，計(jì)算RSD為1.96%，表明所制備的供試品溶液在12 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定性較好。

2.6.10 重復(fù)性考察 取同一批次樣品6份，按“2.6.4”和“2.6.5”項(xiàng)下總酚和不被吸收多酚的方法制備，測(cè)定總鞣質(zhì)的含量，結(jié)果總鞣質(zhì)的平均含量為25.63 mg/g，計(jì)算RSD為1.99%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.11 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同批已知總鞣質(zhì)含量的軟膏樣品6份，每份0.50 g，分別精密加入沒(méi)食子酸對(duì)照品12.80 mg，按供試品溶液的方法制備，測(cè)定總鞣質(zhì)的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，平均回收率為93.45%，RSD為2.69%，因此該方法樣品處理方法可行。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6.12 樣品的含量測(cè)定 取“2.3”項(xiàng)下的制備3個(gè)不同批次軟膏，精確稱取1.00 g，每批次各3份，按“2.6.4”和“2.6.5”項(xiàng)下總酚和不被吸收多酚的方法制備，測(cè)定總鞣質(zhì)的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。3個(gè)批次軟膏的含量為24.34～27.10 mg/g，RSD為0.64～2.23%。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

研究制備軟管為O/W型，硬脂酸與三乙醇胺作用生成的硬脂酸三乙醇胺一價(jià)皂，為陰離子型乳化劑，所制得的軟膏pH約為8左右，刺激性較鉀皂、鈉皂小，成品較細(xì)膩有光澤但化學(xué)穩(wěn)定性較差。根據(jù)文獻(xiàn)資料[14]，藥物的量及成分性質(zhì)影響藥物的穩(wěn)定性，主要有兩個(gè)影響過(guò)程：第一，隨時(shí)間而分層，大部分主藥可能會(huì)遷移到與其極性相似的相體系中，造成主藥在軟膏中分布不均勻；第二，粒度的增加，制備過(guò)程中強(qiáng)剪切力形成的多相微粒體系隨時(shí)間增加而喪失表面能，逐漸合并聚集成大顆粒。研究表明[15]，乳狀液的液滴大小明顯隨乳化溫度而改變，所以乳化溫度宜控制在70～90 ℃較為合適。在預(yù)試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，乳化時(shí)間對(duì)軟膏的乳化影響較為明顯。因此選用藥物與基質(zhì)比例、乳化時(shí)間和乳化溫度三個(gè)因素優(yōu)化軟膏制備工藝，解決該軟膏穩(wěn)定性差的問(wèn)題，得到優(yōu)化制備工藝參數(shù)。

軟膏制備工藝時(shí)，藥物為40%乙醇洗脫部位，在水中溶解性較差，因此加入少量乙醇(可對(duì)皮膚可產(chǎn)生刺激性，只能加少量)超聲溶解后與水相攪拌混合均勻，使藥物混懸在水相中。羥苯乙酯在軟膏中的防腐劑。因用量小，直接加固體粉末不易均勻，用醇溶液使分散均勻。鞣質(zhì)是一類復(fù)雜的具有沉淀蛋白質(zhì)性質(zhì)的水溶性多元酚類化合物，見(jiàn)光易分解，故本實(shí)驗(yàn)鞣質(zhì)的含量測(cè)定過(guò)程中應(yīng)避光操作且使用棕色瓶存儲(chǔ)溶液。在總鞣質(zhì)的測(cè)定中，軟膏基質(zhì)有一定影響，采用冰浴冷卻，快速過(guò)濾膜的方法去除基質(zhì)干擾。

綜上，該軟膏的制備是為了滿足臨床需要對(duì)原有醫(yī)院制劑進(jìn)行劑型開(kāi)發(fā)，采用分離試驗(yàn)和高溫試驗(yàn)評(píng)估軟膏的成型工藝，確保軟膏質(zhì)量穩(wěn)定同時(shí)建立軟膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為該制劑的二次開(kāi)發(fā)打下基礎(chǔ)。后期將按照《中國(guó)藥典》2015版軟膏項(xiàng)下檢查指標(biāo)開(kāi)展微生物檢查等相關(guān)檢查試驗(yàn)，加快開(kāi)發(fā)進(jìn)度。