梓醇對(duì)衰老大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用研究

，， ， ，

人口老齡化是當(dāng)前世界各國(guó)所面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。如何延緩衰老是科學(xué)家們不懈探索的重大課題。增齡常伴隨著血管結(jié)構(gòu)和功能的改變，是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的危險(xiǎn)因素之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)改變是人類衰老和疾病的基礎(chǔ)。近年來(lái)，細(xì)胞凋亡與衰老關(guān)系的研究已成為熱點(diǎn)?，F(xiàn)有的資料認(rèn)為細(xì)胞凋亡與衰老過(guò)程中組織器官功能的退化、衰老相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。梓醇(catalpol)是玄參科植物地黃的主要成分，是一種環(huán)烯醚萜類葡萄糖苷類化合物。含地黃的中藥口服后有抗衰老、降血糖、利尿、強(qiáng)心、抗凝血、提高免疫力、抗腫瘤等作用[1-2]。目前梓醇對(duì)神經(jīng)細(xì)胞及腦血管的保護(hù)作用有較多的報(bào)道[3-6]。而梓醇對(duì)衰老血管的保護(hù)作用研究相對(duì)較少。本研究通過(guò)建立D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠衰老模型，應(yīng)用地黃提取物梓醇對(duì)衰老大鼠進(jìn)行干預(yù)，旨在了解梓醇對(duì)衰老大鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，為臨床應(yīng)用梓醇防治血管老化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康Wester清潔級(jí)3月齡雄性大鼠32 只，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(清潔級(jí)SXCK，2009-0001)，體重220 g±20 g。普通飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后備用。

1.2 藥品與試劑 梓醇，純度≥98%，購(gòu)自南京景竹生物科技有限公司，批號(hào)：A2002005；D-半乳糖購(gòu)自源葉生物科技有限公司，批號(hào)：HA0426CA14；細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit，POD)購(gòu)自Roche公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax及Caspase-3多克隆抗體均購(gòu)自基爾頓生物科技(上海)有限公司；SYBR Green PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒為T(mén)hermo公司產(chǎn)品；PCR引物由上海捷瑞合成。

1.3 儀器 BIO-RAD公司Mini protean 3 cell型電泳儀，大連競(jìng)邁科技有限公司PS-9電轉(zhuǎn)儀，MK3型芬蘭雷勃酶標(biāo)儀，OLYMPUS(CX41)公司正置顯微鏡，日本JEM1230透視電子顯微鏡。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物模型制備 將32只大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。即正常組、衰老模型組(模型組)、梓醇低劑量組(低劑量組)、梓醇高劑量組(高劑量組)。衰老模型的制備參照文獻(xiàn)[7-8]。除正常組外，其他3組大鼠均用D-半乳糖造模[100 mg/(kg·d) D-半乳糖腹腔注射]，正常組用同體積生理鹽水皮下注射。

1.4.2 給藥方法 6周后衰老大鼠造模成功。低劑量組及高劑量組分別采用不同劑量梓醇[5 mg/(kg·d)及10 mg/(kg·d)]，分別用生理鹽水配制成3 mL液體腹腔注射，模型組與正常組均采用同等體積生理鹽水腹腔注射。第18周末(12周后)每組隨機(jī)抽取3只大鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，有陽(yáng)性改變則結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 標(biāo)本采集 所有大鼠第18周末(12周后)取血待用，并去頭處死后取主動(dòng)脈備用。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài) 取降主動(dòng)脈段固定過(guò)夜，常規(guī)脫水，透明、浸蠟、包埋，制備石蠟切片，切片厚度約5 μm，進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)及內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)。另取2 mm×3 mm主動(dòng)脈標(biāo)本，用25%戊二醛2 mL固定，掃描電鏡觀察各組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。

1.5.2 主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率 取石蠟包埋的主動(dòng)脈，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)的帶熒光的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)。結(jié)果根據(jù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞分布情況，每張切片拍攝10個(gè)陽(yáng)性視野，每個(gè)視野記數(shù)30個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以平均計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比作為細(xì)胞凋亡率(apoptotic rate，AR)。

1.5.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控基因 將主動(dòng)脈制成組織勻漿，離心后取上清液。免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因凋亡蛋白酶-半胱天冬酶-3(Caspase-3)蛋白；RT-PCR法檢測(cè)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因Bcl-2及Bax的表達(dá)。PCR引物由上海捷瑞合成，其他常規(guī)試劑均為國(guó)藥產(chǎn)品分析純。具體引物見(jiàn)表1。

表1 Bcl-2與Bax Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)引物

2 結(jié) 果

2.1 梓醇對(duì)各組大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響 光鏡下顯示：正常組主動(dòng)脈內(nèi)膜光整，中層平滑肌細(xì)胞行走清晰，無(wú)增生。模型組主動(dòng)脈內(nèi)膜不光整，有細(xì)胞缺失表現(xiàn)，中層平滑肌細(xì)胞增生明顯，排列紊亂。梓醇低劑量組及高劑量組上述病理?yè)p害均較模型組明顯減輕，且高劑量組較低劑量組改善更為明顯。HE染色后光鏡下主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?cè)斠?jiàn)圖1。

正常組

模型組

低劑量組

高劑量組

圖1 HE染色后光鏡下主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(×200)

2.2 梓醇對(duì)各組大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)因子的影響 模型組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組，梓醇低劑量組與高劑量組細(xì)胞凋亡率均明顯低于模型組，且高劑量組低于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組Bcl-2的表達(dá)量明顯低于正常組，而梓醇高劑量組明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；梓醇低劑量組Bcl-2的表達(dá)高于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；梓醇高劑量組Bcl-2的表達(dá)明顯高于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組Bax的表達(dá)明顯高于正常組，而梓醇高劑量組明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；低劑量組Bax的表達(dá)略低于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組Bcl-2/Bax比值明顯低于正常組，梓醇低劑量組與高劑量組均明顯高于模型組，且高劑量組明顯高于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯高于正常組，梓醇低劑量組與高劑量組均明顯低于模型組，且高劑量組低于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表2。TUNEL圖像詳見(jiàn)圖2。

表2 梓醇對(duì)各組大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)因子的影響(±s)

正常組

模型組

低劑量組

高劑量組

3 討 論

血管內(nèi)皮的完整性和功能正常對(duì)維持血管壁光滑和血流通暢具有重要意義。衰老常伴隨著血管結(jié)構(gòu)和功能的改變，是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的危險(xiǎn)因素之一。大量研究表明增齡是血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損害的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。細(xì)胞凋亡是當(dāng)今生命科學(xué)中最熱的研究領(lǐng)域之一。隨著衰老及其相關(guān)研究領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到細(xì)胞凋亡在衰老方面的重要性，普遍認(rèn)為細(xì)胞凋亡對(duì)細(xì)胞衰老起主要作用，并引起細(xì)胞特征性形態(tài)改變及衰老性生長(zhǎng)停滯。細(xì)胞凋亡是一個(gè)細(xì)胞自我破壞的程序性生化過(guò)程，是多細(xì)胞生物體內(nèi)的一個(gè)重要生命現(xiàn)象，既出現(xiàn)在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，也出現(xiàn)在正常生理狀態(tài)或疾病中。細(xì)胞凋亡是在一定的生理或病理?xiàng)l件下，細(xì)胞遵循自身的程序，自己結(jié)束生命的過(guò)程，最后細(xì)胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，被其他細(xì)胞吞噬。一般來(lái)說(shuō)觸發(fā)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以分為外部死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。在這些途徑中，很多基因及因素參與了影響及調(diào)控。Bcl-2是細(xì)胞凋亡抑制基因，名稱來(lái)源于B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-celllymphoma/leukemia-2)，是目前發(fā)現(xiàn)的與凋亡關(guān)系密切的原癌基因。Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞生存期作用，因而被稱為長(zhǎng)壽基因。Bax基因是Bcl-2家族的一員，其產(chǎn)物是一種與Bcl-2同源的相關(guān)蛋白，能夠拮抗后者的生物學(xué)活性[9]。Bax的主要作用是加速細(xì)胞凋亡，細(xì)胞存亡決定于凋亡基因及凋亡抑制基因表達(dá)的多少。研究表明，Bcl-2及Bax兩者間的比例較絕對(duì)量對(duì)于細(xì)胞、組織的影響更為重要，Bcl-2/Bax比值是決定細(xì)胞成活與否的關(guān)鍵因素。

細(xì)胞凋亡過(guò)程中，半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族充當(dāng)了重要的角色。Caspase是一種具有特異天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，是一組在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用的酶，是直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，在細(xì)胞凋亡機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中居中心地位。Caspase家族是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵元件，其激活與超常表達(dá)均引起細(xì)胞凋亡，因此又稱死亡蛋白酶。在已發(fā)現(xiàn)的Caspase家族14個(gè)家族成員中，Caspase-3處于凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是最重要的效應(yīng)型Caspase，是Caspase家族中的最重要和最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者之一，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的主要效應(yīng)因子。正常狀況下，胞質(zhì)中的Caspase-3無(wú)活性，以Procaspase-3形式存在。當(dāng)細(xì)胞接受凋亡刺激時(shí)，被系列反應(yīng)激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此，Caspase-3的表達(dá)不但反映細(xì)胞的凋亡水平，而且反映凋亡啟動(dòng)因素的存在?，F(xiàn)在一般認(rèn)為Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，也是細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分，其活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志。

本研究觀察到，利用D-半乳糖制造的衰老大鼠與正常組比較，主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)明顯受損，細(xì)胞凋亡率明顯增加，促凋亡基因Caspase-3及Bax表達(dá)明顯增加，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)明顯減少，特別是Bcl-2/Bax比值明顯下降。說(shuō)明衰老血管內(nèi)皮功能的損害與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

梓醇是中藥地黃的提取物，現(xiàn)有的研究已經(jīng)證實(shí)，梓醇具有抗氧化損傷、抗炎、抗癌、神經(jīng)保護(hù)、利尿、降血糖、抗肝炎病毒、止血解痙等作用。目前，對(duì)于梓醇在神經(jīng)系統(tǒng)方面的保護(hù)作用研究相對(duì)較多，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)梓醇具有減輕腦缺血再灌注損傷及抑制腦細(xì)胞凋亡等神經(jīng)保護(hù)作用[10-13]。然而，有關(guān)梓醇對(duì)衰老大鼠血管內(nèi)皮功能的影響報(bào)道尚少。本實(shí)驗(yàn)顯示：梓醇低劑量組與高劑量組均能改善D-半乳糖所致的衰老大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)損害。同時(shí)，均能降低衰老所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，下調(diào)促凋亡基因Caspase-3的表達(dá)。梓醇高劑量組能顯著上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2及下調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)。雖然梓醇低劑量組未能明顯改變衰老大鼠主動(dòng)脈血管Bcl-2及Bax的水平，但能明顯上調(diào)Bcl-2/Bax比值。表明梓醇能明顯保護(hù)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠的血管內(nèi)皮損害，這種保護(hù)作用呈一定的劑量依賴性。梓醇對(duì)衰老血管的保護(hù)機(jī)制可能與其抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān)?？梢?jiàn)傳統(tǒng)中藥地黃提取物在抗血管衰老方面有良好的應(yīng)用前景。